[发明专利]一株链霉菌及利用其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，尤其涉及一株链霉菌及利用该株链霉菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法。

背景技术

香兰素，又名香草醛、香荚兰素，英文名为vanillin，分子式为C₈H₈O₃，分子量为152.14。香兰素外观为白色至微黄色针状结晶或粉末，呈香荚兰豆特有的香气，微甜，在潮湿的空气中缓慢氧化为香兰酸。沸点为284～285℃，相对密度为1.056，微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸、二硫化碳和吡啶等有机溶剂。

香兰素是世界上产量最大、用途最广的香料之一，被誉为“香料之王”，广泛应用于巧克力、冰激凌、糖果等食品以及香烟、饮料和高档化妆品中。它不仅可以用作增香剂和定香剂，还可在食品中用作防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂。在化学工业中，香兰素可抑制润滑剂发泡，用作镀锌槽的增白剂、锌电镀的活性剂。香兰素也是重要的医药合成中间体，用作生产L-多巴、L-甲基多巴和罂粟碱的基础原料。目前世界市场上香兰素的需求为每年1.5万吨，且以每年10％的速度增长。

目前常用的香兰素生产方法是植物原料提取法和化学合成法。香兰素是天然香荚兰的主要成分，其在香荚兰豆中的含量约为15～20克/千克。香荚兰在种植过程中需要对花朵进行人工授粉，劳动强度大，难以进行大规模栽种，从植物原料提取不能满足日益增长的天然香兰素市场需求，其年产量仅为2000吨左右。目前市场上绝大多数的香兰素产品是通过化学合成的，常用的合成底物包括丁香酚、木质素、乙醛酸、黄樟素和愈创木酚等。国内常用的是采用愈创木酚和乌洛托品反应的亚硝化工艺，该方法线路长，分离过程复杂，收率低，环境污染严重，原料消耗高，国外早已被淘汰。国外主要采用愈创木酚和乙醛酸缩合工艺，该工艺设备简单，产率较高，但还处于研究阶段，未能应用于工业化生产。总体来说，化学合成法工艺成熟，产物纯度高，原料来源广泛，但存在严重的缺陷，比如环境污染严重，产品香气单一，易掺杂质，合成香兰素的安全性也受到质疑。

随着生活水平的提高，人们对天然绿色产品的需求也越来越高。与化学合成相比，生物法合成香兰素具有反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品安全可靠等优点，正日益受到人们的重视。美国FDA规定，天然香料必须是由来自于植物或动物的原料通过物理，酶法或微生物加工过程得到的产品。在这种背景下，应用各种廉价的天然原料通过生物技术生产香兰素成为研究的一个热点。目前已经发现，芽孢杆菌、链霉菌、假单胞菌和沙雷氏菌等微生物能利用转化多种底物生成香兰素，这些底物包括阿魏酸、木质素、香兰酸、丁香酚和异丁香酚等等，其中研究得较为深入的是阿魏酸和丁香酚。但以丁香酚为底物的生产工艺，产物香兰素浓度很低，目前还达不到工业化生产的要求。

据报道能转化阿魏酸生产香兰素的微生物很多，产量多在10克/升以下。产量最高的两株菌是Rabenhorst(1996)报道的Streptomyces setonii ATCC39116和A.Muheim(1998)报道的Amycolatopsis sp.HR167，香兰素浓度分别达到12克/升和11.5克/升。由于香兰素在10克/升以上就可以结晶，以上两种已经接近产业化的水平。但应用这两个菌株生产香兰素时培养基成分较为复杂，生产成本较高，副产物较多包括香兰酸、香兰醇和愈创木酚等，给产品的分离提取带来了相当的困难。

发明内容

针对目前市场对天然绿色产品的需要，以及生物法生产香兰素得率较低、副产物多、生产成本高等问题，本发明提供了一株链霉菌，该菌株名为Streptomyces sp.V-1，于2006年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 206065，其特征是：气生菌丝亮黄色、基内菌丝浅黄色，基内菌丝无横隔、不断裂，孢子椭圆形、表面光滑，可利用葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖，不能液化明胶，不产硫化氢，该菌株的16S rDNA序列与多株链霉菌的16S rDNA序列相似性达到97～98％。

利用该株链霉菌Streptomyces sp.V-1生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，其涉及的详细步骤如下：

(1)斜面培养：将链霉菌Streptomyces sp.V-1接种固体斜面培养基上，在30℃条件下，静置培养24小时；

(2)制备种子培养液：用步骤(1)所得的斜面培养物，接种到液体种子培养基中，在30℃条件下，120转/分钟振荡培养24小时，制得种子培养液；