[发明专利]Leydig细胞的分离方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程和细胞移植中的种子细胞，尤其涉及睾丸间质内细胞的分离方法及其用途。

背景技术

雄激素缺乏症在男性科、泌尿外科及整形外科等许多相关临床科室都很常见。近年来，随着生活节奏加快、工作压力增加、肥胖和人口老龄化等问题的出现，雄激素缺乏患者有逐年上升的趋势，并已成为世界范围内严重威胁男性健康和生活质量的难治性疾病。目前临床上针对雄激素缺乏的治疗仍无长期稳定的有效措施。较常用的方法是补充外源性睾酮治疗，但睾酮补充治疗需长期应用，且无法达到人体有节律睾酮分泌的生理要求，最终常会引起高血压、水钠潴留等一系列并发症。因此，如何有效地治疗这类疾病已成为越来越多研究者关注的热点。

哺乳动物雄性激素主要由睾丸间质内莱迪希氏(Leydig)细胞和肾上腺髓质网状带产生，其中由Leydig细胞产生的雄性激素占全部水平的95％，是体内雄激素的最主要来源。因此，要从根本上治疗雄激素缺乏症，关键是如何有效恢复体内Leydig细胞的数量和功能。已有诸多研究证实，Leydig细胞移植能显著提高受体血雄激素水平。

Leydig细胞是存在于睾丸间质内的一种内分泌细胞，其主要功能是在下丘脑-垂体促性腺激素轴的调解下分泌睾酮等雄性内分泌激素，因此，体外分离纯化的Leydig细胞常被用于雄激素水平低下的细胞治疗研究。

许多研究证实，成熟的Leydig细胞为终末分化细胞，不具备有丝分裂能力，其在体数量的维持主要依靠Leydig细胞的干细胞(stem Leydig cells，SLC)及前体细胞(Progenitor Leydig cells，PLC)。所以，分离和纯化后所得细胞内SLC和PLC的存在将直接影响Leydig细胞数量和睾酮生成功能的维持。

目前获得高纯度Leydig细胞的经典方法是细胞淘洗及Percoll密度梯度离心，其最突出的缺点是分离技术繁杂，操作步骤多，历时长。经过此两种分离方式后，细胞损伤很大，获得率低，存活率低，难以扩增，且不能在体外维持长久的睾酮生成功能，很难满足细胞治疗及组织工程化组织构建对细胞数量和功能的双重要求。而且在这些操作过程中，会造成Leydig干细胞和前体细胞的大量流失，导致Leydig细胞数量和功能无法长期维持。

因此，本领域迫切需要一种获得大量有功能的Leydig细胞的方法，以解决细胞治疗研究和雄激素分泌组织构建技术发展的瓶颈问题。

发明内容

本发明旨在提供一种获得大量纯度高且含有干细胞和前体细胞的Leydig细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供上述方法得到的Leydig细胞的用途。

本发明的再一个目的是提供一种由上述方法得到的Leydig细胞构建的移植物。

在本发明的第一方面，提供了一种获得Leydig细胞的方法，它包括步骤：

a.将用胶原酶消化的睾丸组织通过孔径为20-100μm的滤网过滤，得到睾丸间质组织内细胞；

b.将获得的睾丸间质组织内细胞在培养液中培养10分钟-4.5小时，取贴壁细胞得到Leydig细胞。

在另一优选例中，步骤(a)前还包括步骤：去除白膜和可见血管，用胶原酶消化睾丸组织至结构松散而曲细精管基本连续的状态。

在另一优选例中，步骤a中所用的胶原酶浓度0.01-5％，其中所含的胶原酶消化液与睾丸组织的体积(毫升)重量(克)比为1-5∶1。

在另一优选例中，所述的胶原酶选自I型胶原酶、II型胶原酶或复合胶原酶。

在另一优选例中，所述的胶原酶是复合胶原酶。

在另一优选例中，所述的复合胶原酶是NB4。

在另一优选例中，胶原酶消化睾丸组织的时间为3-30分钟。

在另一优选例中，用0.25％复合胶原酶NB4消化5分钟。

在另一优选例中，所述的过滤网孔为25-50μm。

在另一优选例中，所述的过滤网孔为30-40μm。

在另一优选例中，所述的过滤网孔为33μm。

在另一优选例中，步骤b中贴壁培养时间为0.5-3小时。

在另一优选例中，步骤b中贴壁培养时间为2小时。

在另一优选例中，步骤b的培养液中含血清0-10％。

在另一优选例中，所述的培养液中含血清0-1％，更佳地0％。

在另一优选例中，步骤a中的睾丸组织取自哺乳动物。

在另一优选例中，步骤a中的睾丸组织应保持睾丸形态的完整和曲细精管的连续性。