[发明专利]表面等离子体共振的生物传感器的生物芯片、制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于表面等离子体共振生物传感器的细胞表面受体生物芯片、制备方法及应用，所提供的芯片主要用于研究类胰岛素等酪氨酸激酶受体与细胞内上游信号蛋白相互作用动力学，以及激酶抑制剂对相互作用影响。属于蛋白质生物芯片领域。

背景技术

细胞表面受体与其下游信号蛋白的相互作用传统的研究方法有免疫沉淀、蛋白印迹及酵母双杂交。免疫沉淀及免疫印迹依靠与信号蛋白或受体结合的抗体特异性，其灵敏度度低，不足以进行蛋白间微弱相互作用的检测。酵母双杂交已用于研究胰岛素/类胰岛素受体(IR/IGF-1R)与其信号蛋白间的相互作用，此法比免疫印迹灵敏，蛋白间微弱的相互作用即可激活报告基因的转录与翻译，但不能给出定量信息，如膜受体与胞外配体或胞内受体结合蛋白及底物因缺乏相应的方法而不能获得其相互作用的动力学及热力学特征常数。而且，由于信号的产生依赖于酵母的转录与翻译系统，不能排除酵母系统本身对蛋白相互作用的影响。目前表面等离子体共振生物传感器已广泛应用于生物及医学的各个领域，包括：抗原决定组定位(epitopemapping)，蛋白-DNA相互作用，药物筛选等。并应用于类胰岛素信号转导中上游信号蛋白的相互作用，例如：类胰岛素生长因子(IGF-1)与IGF-1结合蛋白相互作用。基于表面等离子体的胰岛素底物(IRS-1)多肽片断与PI3K相互作用用于胰岛素受体拮抗剂筛选，抗体修饰的表面用于从细胞裂解液中直接捕获表面生长因子受体，直接用来研究PDGF受体与其胞外配体的相互作用。

发明内容

为克服传统方法研究类胰岛素受体与胞内蛋白相互作用非实时性及复杂性，本发明基于表面等离子体生物传感器的CM5芯片，采用抗体捕获的方法制备了类胰岛素受体(IGF-1R)的蛋白质芯片并用此芯片研究IGF-1R和与其直接相互作用信号蛋白间相互作用。

本发明的目的是提供一种研究细胞表面受体与其信号蛋白分子和抑制剂相互作用的实时检测的蛋白芯片、制备方法及应用。本发明的细胞表面受体蛋白芯片的构成有是在玻璃基底上有金表面镀膜，金表面膜上固定有葡聚糖凝胶层，在葡聚糖凝胶层上固定单克隆抗体，通过抗体捕获并固定表面受体。固定的受体分子可以用SPR直接观察受体与信号分子相互作用，以及抑制剂对该相互作用的影响。

SPR能检测传感片表面的折射率变化，当P偏振光从金属表面一侧的光密介质射向光疏介质时，某一角度的反射光呈明显的暗带，此角度(SPR共振角)主要依赖于传感片表面的物质的质量；当生物分子结合到传感片表面或传感片表面物质量发生变化时，其共振角将发生变化(见图1.从I到II的变化)，共振角的变化可通过观察共振信号随时间变化的函数(与质量变化呈正比)可进行无侵入性实时性观测。

抗类胰岛素受体beta亚基的单克隆抗体固定于CM5芯片表面，制成类胰岛素受体(IGF-1R)的蛋白质芯片，来捕获过表达人细胞裂解液中类胰岛素受体，然后利用此芯片研究并比较IGF-1R与胞内各信号蛋白质相互作用动力学常数。

所述的抗类胰岛素受体Beta亚基的单克隆抗体是NeoMarkers公司的MS-641-PIABX或MS-641-PABX，其缓冲液中不含一级胺，如：Tri-HCl和稳定剂牛血清白蛋白，且其固定量在1000-2000RU，并根据不同的实验目的，固定量作以调整，或用Calbiochem公司的抗类胰岛素受体Beta亚基的单克隆抗体Ab-1，目录号：GR11L，因含有1∶1BSA，固定量相应加大至3000-5000RU，并根据不同实验目的固定量作以调整；

所述的来捕获IGF-1R表达细胞裂解液中类胰岛素受体的特征是直径10mm平皿铺满80％的过表达重组人源IGF-1R的细胞需500μL裂解液，顺序12,000转高速离心15分钟和70,000转超速离心30分钟，制备含有过表达的类胰岛素受体的细胞裂解液上清液，此上清液70μL直接通过固定有抗体的CM5表面7分钟，IGF-1R固定量一般为600-800RU；