[发明专利]肝癌相关基因DLK1及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体地，本发明涉及肝癌相关基因DLK1、以其mRNA序列为靶点的一组siRNA、及其在制备诊断肝癌试剂、制备基因治疗肝癌的药物中的应用。

背景技术

目前我国有慢性肝炎患者约1200万例，每年死于肝病约30万，其50％为原发性肝癌，约占全世界肝癌死亡人数的45％左右。绝大多数与HBV、HCV感染有关。肝癌发病率在我国居2-3位，主要在青壮年男性发病，在华东地区的发病率明显高于其他地区，近年来，有持续上升趋势。在上海，肝癌的发病率居第三位，仅次于肺癌和胃癌。最新资料显示这个比例还有继续上升的趋势。现在，肝癌，特别是肝炎病毒引起的肝癌已经严重危害了我国人民生命安全。因此，非常有必要对肝癌发生的分子机制作深入的研究。

随着人类基因组测序的完成，基因组学的研究重点已经转移到以解析基因功能为主的功能基因组学研究。功能基因组学的重点是以疾病为中心，全力解决人类疾病相关基因研究中的重大科学问题。肝癌在我国素有“国病”之称，经过半个世纪的探索，对于肝癌的早期诊断和治疗虽然有了一定的认识，但肝癌预后仍然很差，特别是对其发病机制的了解及治疗药物的新靶点方面，更是知之甚少。因此，寻找与肿瘤相关的基因，特别是寻找新的抑癌基因是近年来肿瘤研究的热点。DLK1基因定位于染色体14q32上。DLK1是在胞外区域包含6个EGF样重复序列的糖基化Delta样跨膜蛋白。DLK1首先是在脂肪前体细胞中发现，与脂肪细胞的分化紧密相关。DLK1基因具有抑制脂肪前体细胞向脂肪细胞分化的功能。近年来，有研究发现DLK1在神经母细胞瘤细胞和小细胞肺癌细胞株等肿瘤细胞中存在表达，表明DLK1基因可能与肿瘤发生相关；同时在老鼠的胎肝细胞和胆汁淤积引起的肝纤维化细胞中均发现DLK1的表达。在我们的前期肝癌及癌旁表达谱分析的研究中，发现DLK1基因在肝癌中的表达较癌旁组织中明显增加，提示DLK1基因可能对肝癌的发生相关。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肝癌相关基因DLK1的mRNA序列，盖基因定位在人染色体14q32上，可用于制备治疗原发性肝癌的RNA干扰药物。

为解决上述技术问题，本发明提供肝癌相关基因DLK1的mRNA序列。

本发明还提供一种表达载体，含有所述以DLK1上mRNA为靶点的siRNA序列。

本发明还提供一种含有所述表达载体的宿主细胞。

在本发明的再一方面，还提供了一种用于治疗肝癌的试剂盒，其含有所述的以DLK1上mRNA为靶点的siRNA。

在本发明的又一方面，还提供了一种用于治疗肝癌的生物芯片，其含有以DLK1上mRNA为靶点的siRNA。

在本发明的又一方面，还提供了肝癌相关基因DLK1在制备诊断肝癌及肿瘤的试剂，和制备基因治疗肝癌及肿瘤的药物中的应用。

本发明由于对DLK1基因进行了体外动物细胞试验，证实DLK1缺失能够导致肝肿瘤细胞显著缩小，认为DLK1基因在进行制备治疗肝癌的基因药物中有巨大作用，可以成为基因治疗的靶点。

附图说明

图1是实施例1中pSUPER DLK874和pSUPER DLK1011的RNA干扰效率示意图，其中，pSUPER为空载对照，pSUPER Luc+为阴性对照；

图2是实施例2中三次克隆实验中的一次的实验照片；

图3是实施例2中从上到下为Hep3B、HepG2和Huh-7细胞在三次独立实验中的克隆数目统计图，其中，*表示与对照组比较时p值＜0.05；

图4是实施例3中DLK1表达稳定下调的Huh-7细胞株的鉴定示意图，其中，β-actin作为各样品蛋白上样量对照；

图5是实施例3中DLK1表达稳定下调Huh-7细胞株的生长曲线比较示意图，其中，细胞活力在450nm波长处测量，每点上下所标的黑色刻度线标志为其标准差；

图6是实施例4中DLK1表达下调的Huh-7细胞在裸鼠体内的成瘤性降低示意图；上图为4周后携带肿瘤的裸鼠照片，皮下的肿瘤呈圆块状；下图为4周后取下的皮下肿瘤照片，其中Huh-7 p1011 A4细胞在六周后仍无肿瘤形成；

图7是实施例5中SMMC-7721瞬间转染pcDNA3.0和pcDNA3.0-DLK1后的生长曲线示意图；