[发明专利]一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法

权利要求书

1.一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法，其特征是，在温度为0-4℃的条件下，按以下步骤完成：

a、均浆：把新鲜的大蒜粉碎，按每千克新鲜大蒜加入800-1200mL pH6-8的缓冲液的量计算，在粉碎后的新鲜大蒜内加入缓冲液，同时进行搅拌使它们混合均匀；

b、提取上清液：将经步骤a所得物质进行冷冻离心处理，而后提取上清液；

c、盐析：在步骤b中提取的上清液内加入饱和硫酸胺溶液，加入同时进行搅拌；

d、溶解：把经过盐析后得到的上清液做冷冻离心处理，而后去掉上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液内；

e、超滤：把溶解后的滤饼用截留分子量为1万-5万的滤膜过滤，得到截留物，即为新鲜大蒜的蒜氨酸粗液；

f、分离纯化：把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离：并用pH6-8的缓冲液以10-60mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，收集洗脱液组分；再把它透析得到纯化的蒜氨酸酶。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征是，在步骤a中所加入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、甘油、NaCl、EDTA，和磷酸吡哆醛配制而成；在粉碎后的新鲜大蒜中加入缓冲液时，搅拌速度为每分鐘5000-10000转；

在步骤b中，均浆后的物质冷冻离心3-57分钟；

在步骤d中，把经过盐析后的物质，做冷冻离心的时间为10-50分钟；滤饼重新溶入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、蔗糖、NaCl和磷酸吡哆醛制成；

在步骤e中，应将溶解后的滤饼先做冷冻离心处理，而后再进行超滤，超滤是在压力为0.25MPa的情况下操作的；

在步骤f中，缓冲液由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaCl、、磷酸吡哆醛制成。

3.根据权利要求2所述的分离纯化方法，其特征是，在步骤a中所加入的磷酸缓冲液，其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由50-80mM的NaH₂PO₄、50-80mM的Na₂HPO₄、8-12％v/v的甘油、4-6％w/v的NaCl、4-6mM的EDTA、4-6μM的磷酸吡哆醛配制而成；

在步骤c中，所加入饱和硫酸胺溶液为30-60％的饱和硫酸胺溶液；

在步骤d中，滤饼重新溶入的磷酸缓冲液其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由55-65mM的NaH₂PO₄和55-65mM的Na₂HPO₄、8-12％v/v的蔗糖，1-5％w/v的NaCl、1-10μM的磷酸吡哆醛配制而成；

在步骤f中所采用的缓冲液其配制比例为：1000mL的缓冲液由50-80mM的NaH₂PO₄、50-80mM的Na₂HPO₄、1-5％w/v的NaCl、10-40μM的磷酸吡哆醛配制而成。