[发明专利]胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测试剂领域，具体就是胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法。

背景技术

免疫球蛋白(IgG)是广泛分布于动物脑脊液和血清中的一种蛋白质，能够促进免疫细胞对病原体的吞噬；促进免疫细胞对肿瘤细胞或受感染细胞的杀伤和破坏；当第二次与相同病原体接触时可与之发生凝集反应；是唯一能通过胎盘传递给胎儿的免疫球蛋白，可增强胎儿和新生儿的免疫力。检测它的含量的对于了解动物机体内的免疫状况，健康情况等都有重要的意义。

现有检测血清中IgG总量的方法很多，如：单向免疫扩散法、酶联免疫吸附法(ELISA)等是目前应用最多的两种方法，其中单向免疫扩散法是最经典的方法，这一方法的特点为操作简便，设备简单，测定成本较低，因而这一方法多年来一直为国际上所采用，但其准确度和灵敏度都不是很好。另外，还有酶联免疫吸附法，该法虽然准确度和灵敏度较好，但操作复杂、设备较昂贵，成本高，因而只在一些研究中使用。

发明内容

本发明提供了一个新的简便的免疫检测非特异性IgG的方法，本方法使用较少的蛋白质和标记物，一步完成，在很大程度上缩短了分析时间，一次可使用更多的样品，并且具有很高的敏感度，从而可以在生产实践中广泛用于评估动物的非特异性免疫功能及健康状况等。胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法，包含下列步骤：

1)对每一批制备胶体金标记蛋白A和微量反应板建立标准曲线算出回归方程，包含下列步骤：

(1)设8个标准孔，每孔各加入50uL0.01M PH＝7.4 TBS溶液(含0.1％小牛血清)；

(2)加样：第一孔加标准IgG溶液50uL，然后倍比稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出50uL弃去，使之体积均为50uL，第八孔为空白对照，每孔中标准IgG含量为160、80、40、20、10、5、2.5、0ug/mL；

(3)在反应孔中加入稀释2-6倍50uL胶体金标记蛋白A；

(4)将反应板充分混匀后置室温下作用20-40分钟；

(5)用酶标仪在620nm处测每孔吸光度值，每个标准品的吸光度值减去空白孔吸光度值，即为加入标准IgG引起的吸光度值变化量；

(6)将标准IgG引起的吸光度值的变化量取常用对数，将每孔中标准IgG含量取常用对数，用log-logit作图法建立标准曲线算出回归方程为x＝by+a，其中x是标准IgG含量常用对数，y是标准IgG引起的吸光度值的变化量的常用对数，a、b为算回归方程的常数；

2)样品测定，包含下列步骤：

(1)在样品孔中，加入50uL样品溶液；

(2)在样品孔中加入50uL稀释的胶体金标记蛋白A；

(3)将反应板充分混匀后置室温下作用20-40分钟；

(4)用酶标仪在620nm处测每孔吸光度值，吸光度值减去该批制备的胶体金标记蛋白A和微量反应板建立标准曲线算出回归方程空白孔吸光度值，即为加入样品IgG引起的吸光度值变化量，将样品IgG引起的吸光度值的变化量取常用对数，根据标准曲线回归方程算出相应的IgG量。

上述对每一批制备胶体金标记蛋白A和微量反应板建立标准曲线算出回归方程中在反应孔中加入稀释4倍50uL胶体金标记蛋白A。

上述样品测定中将反应板充分混匀后置室温下作用30分钟。

附图说明

图1 SPA最小用量的测定

图2金探针的活性鉴定

图3金探针的稳定性检测

图4金探针的吸收曲线，1-胶体金、2-金探针

图5最佳金探针浓度的确定

图6最佳pH值的确定

图7曲线1-4℃，曲线2-15℃，曲线3-25℃，曲线4-37℃

图8剂量反应曲线

图9回归曲线

图10方法对比试验

具体实施方式：

本发明所述金探针就是胶体金标记蛋白A。