[发明专利]一种从中性嗜盐菌Halomonas salina检测和提取相容性溶质ectoine的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从中性嗜盐菌检测相容性溶质ectoine的方法

背景技术

在高渗环境中，微生物胞内水的溢出引起膨压减小，细胞体积缩小，相应的细胞内所有代谢物的浓度均升高而造成胞内水活度下降。这时，微生物通过在胞内积累有限的几种小分子溶质以提高细胞内水活度，使细胞的体积和膨压达到正常水平，并避免细胞内所有物质浓度的升高。

大多数耐盐微生物在长期的进化过程中逐步形成了适应渗透压变化的机制，它们通过在细胞内积累小分子有机溶质，如糖，多元醇，甜菜碱，氨基酸等来使细胞内外渗透压达到平衡。1972年Brown将这类能够高浓度积累，具有平衡细胞内外渗透压而又不影响细胞正常代谢功能的有机渗透溶质称为“相容性溶质”(compatible solutes)。到目前为止，已发现的相容性溶质主要有糖类的蔗糖、海藻糖；氨基酸中的脯氨酸、丙氨酸；氨基酸衍生物中的甜菜碱(N-三甲基甘氨酸)；“Ectoines”家族包括(1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸[ectoine]、1，4，5，6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸[hydroxyectoine])以及人工合成的衍生物Decarboxyectoine(4，5，6，7-四氢-2-甲基嘧啶)、Homoectoine(1，4，5，6，7-四氢-2-甲基-1，3-二氮-4-碳酸)。

L-Ectoine            β-Hydroxyectoine    Decarboxyectoine        Homoectoine

Ectoines因在Ectothiorhodospira菌株中发现而得名，它具有高度的可溶性和生理pH条件下的非离子特性，所以成为嗜盐光合细菌主要的渗透压调节剂，ectoines除了可作为细胞、蛋白质、DNA等大分子在高盐、高热、冷冻、干燥、低氧等各种胁迫环境下的保护剂及化妆品和护肤品的保湿剂，还具有许多其他功能ectoines的手性模型(chiral building blocks)使它在化疗中可能可作为健康细胞的保护剂；它还可以清除包括超氧化物、羟氧基自由基、纯态氧及过氧化氢等各种羟自由基。可以作为细胞碳源、氮源和能源的储备形式，为细胞提供在饥饿状态下生存的必要物质以及防止蛋白质的错误折叠以及包涵体的形成，最新研究表明，ectoines对于消除阿尔兹海默氏综合症中形成的致病性不溶性聚合β-淀粉肽有很好的效果。一项最有前途的应用是用ectoines作为PCR稳定剂。

发明内容

菌株：TA-4，XM分离自同安盐田，本发明采用阴离子阳离子交换柱连用对ectoines提取物的初步分离，Ectoine的进一步鉴定采用MECC胶束毛细管电泳法。

附图说明

图1为210nm紫外吸收峰作为检测信号。

图2标准品ectoine的毛细管电泳图谱

图3混合物的毛细管电泳图谱

图4加入内标的混合物的毛细管电泳图谱

具体实施方式

相容性溶质ectoines的分离纯化与鉴定：将经过渗透压震荡的菌体TA-4，XM离心收集并冻干400μl甲醇∶氯仿∶水(10∶5∶4)对冻干细胞进行抽提，剧烈震荡60min，离心13000rpm，30min促进分相，加入130μl同样体积氯仿和水，剧烈震荡30min，再次离心分相。回收含有相容性溶质的水相，冻干后溶于乙醇中。由于ectoines在生理pH值条件(6.8～7.4)下为两性离子，因此当洗脱液的pH为7.0的Tris-HCl缓冲液，ectoines将会从弱碱性阴离子二乙基氨乙基纤维素(简称DEAE-纤维素)和弱酸性阳离子羧甲基纤维素(简称CM-纤维素)串连柱上被洗脱下来，从而与混合物中的其他在生理条件下呈阳离子和阴离子的杂质分离，210nm紫外下检测(ectoines在此波长有强烈吸收峰)收集生理条件下的ectoines与其他有吸收峰的中性物质。在已有的文献中，有人采用先将样品溶液通过阴离子交换柱，收集未结合与柱上的组分，冻干后溶于去离子水，然后再通过阳离子交换柱，收集洗脱组分，冻干得到粗分产物。本文中所采用的阴离子阳离子交换柱连用并以210nm紫外吸收峰作为检测信号的纯化方法不但比两次过柱节省了大量的时间，而且也提高了分离的效率，过柱一次就可以将各种阳离子、阴离子以及210nm下无吸收峰的中性化合物除去。

阴离子阳离子交换柱连用对ectoines提取物的初步分离