[发明专利]从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白L1的方法

权利要求书

1.一种纯化乳头瘤病毒(特别是人类乳头瘤病毒)L1蛋白质的方法，该方法包括如下步骤：

(a)获得表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞，例如大肠杆菌细胞；这可以通过例如将表达有所述乳头瘤病毒L1蛋白质的原核宿主细胞培养物离心、收集细胞而实现；

(b)将所述原核宿主细胞在重悬溶液中重悬，所述重悬溶液含有足以溶解所述乳头瘤病毒L1蛋白质的浓度的盐，优选还含有缓冲液，例如Tris缓冲液(例如20mM Tris缓冲液pH7.2)；

(c)破碎所述原核宿主细胞；优选通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现；

(d)除去不溶性部分，获得菌体裂解上清；优选通过如下方式实施：离心(例如以足以沉降细菌细胞碎片的离心力进行离心)裂解物，留取上清液；

(e)将菌体裂解上清中盐的浓度降低到所述乳头瘤病毒L1蛋白质足以被选择性沉淀的盐浓度；和

(f)非必需地收获沉淀，例如通过离心来实现。

2.权利要求1的方法，其中所述乳头瘤病毒L1蛋白是人类乳头瘤病毒L1蛋白，特别是有利于在原核宿主细胞中以可溶性蛋白质形式表达的L1蛋白质变体，例如截短的L1蛋白质，例如N端和/或C端被截短的L1蛋白质，例如，N端被截短不多于81个氨基酸和/或C端被截短不超过30个氨基酸的HPV 16亚型的L1蛋白质变体，例如SEQ ID NO：6所示的多肽。

3.权利要求1-2任一项的方法，其中步骤(b)中所述重悬溶液所含的盐是中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐中的一种或者几种，特别是NaCl、KCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄；优选地，步骤(b)中所述重悬溶液所含盐的浓度是促进所述乳头瘤病毒L1蛋白质溶解的浓度，例如使得所述乳头瘤病毒L1蛋白质的大约至少60％、优选至少80％、最优选至少90％保持溶解的浓度，例如可以是大约80mM-2500mM，优选100mM-2000mM，更优选200mM-2000mM，例如200-600mM，更优选300-500mM，例如300-400mM。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中步骤(b)中所述重悬溶液所含盐是100mM-2000mM，200mM-1000mM，优选300-500mM，更优选300-400mM，特别是大约300mM NaCl。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中步骤(b)中所述重悬溶液是20mM Tris缓冲液pH7.2，300mM NaCl。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中步骤(e)中所述选择性沉淀使得可溶性乳头瘤病毒L1蛋白质大约至少40％、优选至少60％、最优选至少80％被沉淀，而其它无关蛋白质基本上(例如大约至少40％、优选至少70％、最优选至少80％)不被沉淀；优选地，步骤(e)中所述选择性沉淀得到的沉淀中乳头瘤病毒L1蛋白质占总蛋白的含量为至少50％、至少60％、优选至少70％；优选地，步骤(e)中所述选择性沉淀步骤的乳头瘤病毒L1蛋白质的产率(沉淀前乳头瘤病毒L1蛋白质/沉淀前乳头瘤病毒L1蛋白质)为优选至少70％、至少80％、甚至至少90％。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中步骤(e)中将菌体裂解上清中盐的浓度降低至少50％、至少80％、例如至少90％；例如将所述盐浓度降低到低于150mM、低于100mM、低于50mM、或者不可检测。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中步骤(e)中将菌体裂解上清中盐浓度降低通过透析(例如采用切向流装置透析)来实现，例如采用不含重悬溶液中所述盐的缓冲液透析。

9.权利要求1-8任一项的方法，还包括步骤(g)：采用复溶溶液复溶步骤(f)中获得的沉淀，使得目的乳头瘤病毒L1蛋白质溶解；例如，用含有适当盐(特别是中性盐)的复溶溶液复溶所述沉淀。