[发明专利]稳定同位素18O标记蛋白质组双重定量方法与试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质组学中蛋白质双重定量的方法与试剂盒。包括一种用于定量蛋白质组学的稳定同位素¹⁸O标记结合双酸酐试剂化学标记的蛋白质的新方法与试剂盒。

背景技术

蛋白质组学已经成为当前生命科学研究的重要内容。规模化研究不同生理病理条件下细胞蛋白质的组成及其变化的定量或差异蛋白质组研究，已经成为蛋白质组学研究的热点和难点。蛋白质组研究中的准确定量问题对目前蛋白质组定量方法和技术提出了新的挑战，也越来越受到各国研究人员的重视。

目前，规模化蛋白质组定量方法主要有依赖于2DE的染色方法和稳定同位素标记的质谱检测技术。由于2-DE不能对分子量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量低的蛋白质以及膜蛋白质等进行有效分离和呈现，因而限制了其应用。引进稳定同位素化学标记结合质谱技术的定量策略近年来已经成为蛋白质组学的热点。目前，商品化的定量试剂盒如同位素亲和标签ICAT、iTRAQ试剂等价格都比较昂贵，方法本身也有一定的局限性，使得广泛应用受到了限制。稳定同位素标记的必需氨基酸体内标记SILAC方法仅适应细胞培养模式，不能用于组织或体液中蛋白质组的定量分析。

相比较而言，通过蛋白质酶切时酶促的方法引进¹⁸O原子，由于标记反应步骤少，体系相对简单，因此受到越来越多的关注。蛋白质在H₂¹⁸O水中酶解，在酶促的作用下C-端羧基可稳定结合一个或两个¹⁸O原子，但是由于在C-端羧基结合一个或两个¹⁸O原子是随机的，并且是胰酶依赖的，不同的肽段交换上去的¹⁸O原子时间不同，使得定量复杂化。将蛋白质在¹⁸O的水中通过Lys-N酶酶切，在一定的条件下肽段的C-端羧基可稳定结合1个¹⁸O原子。该方法的缺陷在于Lys-N酶的价格较贵。为了解决现有技术的缺陷，本专利发明了一种基于稳定同位素¹⁸O标记的蛋白质组双重定量新方法。

发明内容

本发明提供了一种基于稳定同位素¹⁸O标记的蛋白质组双重定量新方法。本方法是建立在N端肽段和C端肽段全部标记的基础之上，通过¹⁸O化学标记与酶切标记结合的方法，可以实现对同一样本的两种¹⁸O稳定同位素标记的定量策略。本发明人发现结合多维液相色谱分离手段和多级串联质谱，使用稳定同位素¹⁸O标记蛋白质组双重定量新策略，可以用来提高蛋白质组学相对定量的准确性和可靠性。

本发明提供的一种用于蛋白质组的¹⁸O标记的蛋白质组双重定量新方法，包括：

(1)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；

(2)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；用胍基化试剂对酶切肽段的侧链氨基进行保护；

(3)对肽段进行化学修饰和处理并进行质谱定量，其特征在于所述步骤(3)的处理方法为：

(a)用一种或多种双酸酐试剂对肽段进行修饰，使其与肽段发生乙酰化偶合反应；

(b)第一重定量标记为双酸酐试剂与肽段偶合反应的反应溶液分别为¹⁶O和¹⁸O碳酸氢三乙胺缓冲溶液；双酸酐试剂的一端发生偶合反应，另一端酸酐发生水解反应。修饰后的肽段中，反应体系在H₂¹⁸O配置的碳酸氢三乙胺缓冲溶液的肽段中引入了1个¹⁸O原子。

(c)将等量的两种¹⁸O和¹⁶O标记的肽段经过沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶灭活，然后等比例合并；

(d)用色谱分离手段将合并肽段进行分离，用串联质谱来分析。进行质谱数据的定量分析及蛋白质的鉴定。

为进一步提高分析准确度，本方法还可以继续进行第二重定量，其步骤为：

(e)将(b)中一半的反应溶液，37℃，孵育18h。反应体系为¹⁸O的修饰肽段的C端在胰蛋白酶促的作用下羧基端的两个¹⁶O原子，交换为¹⁸O。

(f)将等量的两种¹⁸O和¹⁶O标记的肽段经过沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶灭活，然后等比例合并；