[发明专利]一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统和其应用

说明书

技术领域

本发明涉及化学领域，尤其涉及生物化学药物领域，特别是一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统和其应用。

背景技术

当前导致严重感染性疾病的病原体如人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)等均通过粘膜表面(生殖道、呼吸道、胃肠道)入侵和感染机体，由于机体不能诱导有效的粘膜免疫应答清除粘膜感染病原体，使病原体迅速扩散入血、进而侵犯全身，造成机体损伤；同时发展为慢性感染，导致严重疾病。

柯萨奇病毒性心肌炎主要由B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染所致，青壮年发病较高，可导致约50％的人类急性及慢性心肌炎和25％扩张性心肌病的发生，是一常见、多发的心血管系统疾病。目前尚无有效的预防或治疗疫苗。CVB3属于肠道病毒，通过呼吸道、胃肠道入侵机体后，由于机体粘膜免疫(如肠道SIgA)不能在感染早期及时清除病毒，使病毒迅速扩散入血、进而侵犯心脏，导致病毒性心肌炎；CVB3的持续性感染还可能导致扩展性心肌病的发生，致死率极高，危害严重。

对于以上经粘膜感染病原体，如能诱导粘膜局部(鼻咽、胃肠道)的特异性粘膜免疫应答，特别是SIgA的分泌，则可能在感染初期有效中和病毒，避免病毒入血而后感染全身器官，从而阻止严重疾病如病毒性心肌炎的发生。因此急需可诱导粘膜SIgA分泌的粘膜疫苗的研制。

已知常规疫苗如灭活、减毒疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗等等经常规途径免疫(肌肉注射、皮下)等通常不能诱导特异性粘膜免疫。无论疫苗的形式，通常靶抗原需要经粘膜部位接种，才能被粘膜APC摄取提呈，激活粘膜免疫系统，诱导粘膜免疫。

已知粘膜接种抗原的瓶颈在于：粘膜局部纤毛的频繁物理摆动可迅速清除外来抗原；粘膜局部存在大量酸性溶液，富含水解酶、DNA酶等，可迅速降解外来抗原。因此粘膜部位接种抗原由于被迅速清除和降解，不能在粘膜局部有效停留，使不足以被APC提呈，不能诱导有效的粘膜免疫应答。即使诱导，其应答程度非常低下。

针对以上抗粘膜感染病原体粘膜疫苗的重要性，以及发展粘膜免疫的主要技术难点，我们认为研制粘膜疫苗的关键在于以下三点：

1)必须发展安全和有效的粘膜递送系统，来递送靶抗原疫苗(特别是DNA疫苗)。该系统应当满足：安全无毒性、缓释性、亲粘膜性、通用性。

2)必须添加粘膜佐剂，有效增强粘膜免疫的诱导。

3)必须发展有效的粘膜免疫方法，如免疫途径、免疫程序、免疫剂量、间隔时间，使能够有效地诱导粘膜免疫。

对于柯萨奇病毒性心肌炎这种特殊的由CVB3粘膜感染导致的疾病，目前尚无有效的预防和治疗疫苗问世。有报道编码CVB3结构蛋白的DNA疫苗经肌肉免疫可诱导IgG和特异性CTL，具有一定的免疫保护能力。我们前期的研究表明：DNA疫苗经肌肉注射免疫不能诱导特异性粘膜免疫，因此不能有效预防病毒性心肌炎发生。其机制是：裸露DNA在粘膜局部被DNA酶等很快降解，无法在粘膜局部进入细胞进行有效表达，不能表达一定量的抗原，则不能诱导粘膜免疫应答。因此我们的目的是如何通过运用粘膜递送体系，来递送DNA疫苗，进行粘膜免疫，从而诱导粘膜SIgA。

本发明的柯萨奇病毒性心肌炎粘膜疫苗的核心疫苗是编码CVB3主要结构抗原VP1(852bp)的DNA疫苗/基因疫苗(pcDNA3.1-VP1)。因此如何应用我们研制的通用粘膜递送系统，有效递送该DNA疫苗，是研制病毒性心肌炎疫苗的关键。欲解决的关键问题如下：

1)利用上述的通用粘膜递送系统，有效递送DNA疫苗。

2)利用上述的粘膜佐剂的应用，以及上述粘膜免疫方法的应用，摸索一种最佳组合，有效诱导CVB3特异性SIgA和IgG，预防病毒性心肌炎发生。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，所述的含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统要解决现有技术中粘膜部位接种抗原时，抗原不能在粘膜局部有效停留、不足以被APC提呈、不能诱导有效的粘膜免疫应答的技术问题。

本发明一种含粘膜佐剂的脱乙酰壳多糖粘膜递送系统，含有靶抗原纳米颗粒和粘膜佐剂纳米颗粒两个组份，所述的靶抗原纳米颗粒由脱乙酰壳多糖与靶抗原编码质粒DNA组成，所述的粘膜佐剂纳米颗粒由脱乙酰壳多糖与粘膜佐剂编码质粒DNA组成。

进一步的，所用的脱乙酰壳多糖的分子量在380000～420000之间，脱乙酰度为75％-85％。

进一步的，所述的靶抗原是粘膜感染病原体的优势抗原，

进一步的，所述的靶抗原是CVB3结构蛋白VP1。