[发明专利]一种采用化学－酶法制备15N－L－酪氨酸的方法

权利要求书

1.一种采用化学一酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：

(1)菌体细胞的制备

a)发酵产酶所采用的微生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏柠檬酸细菌(Citrobacter frevndii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；

b)斜面培养：

培养基为营养肉汁琼脂培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂15.0，蒸馏水1.0L，pH7.0，定容至1.0L，分装，0.1MPa、121℃灭菌20分钟，菌种接入后28℃～32℃培养16～24小时；

c)发酵培养：

以碳源、氮源、无机物配置成发酵培养基，调节其pH值6～9，灭菌后接入斜面种子，于150～260rpm，32℃～40℃，培养16～24小时；

装液量为50ml/500ml，灭菌条件为0.1MPa，121℃，20分钟；

d)发酵液离心得湿菌体，经生理盐水洗涤离心后加入磷酸吡哆醛溶液活化1～3小时，备用；

(2)酶反应

底物反应液：底物4-羟基苯丙酮酸的浓度为0.2％～5％，加入金属离子及¹⁵N氮源后用氨水或NaOH调节pH值为7.5～8.5；

将上述处理所得游离整体细胞作为酶源加入底物溶液中，菌体加入量0.5％～2.5％，在30℃～45℃下反应20～28小时，转速110～150rpm；

(3)提取精制及¹⁵N的回收

反应结束后，将酶反应液调pH至1～3后进行离心，上清液用乙酸乙酯等体积萃取3次，所得水相于旋转蒸发仪上赶酯浓缩，直至蒸干；然后加水溶解至体积为200～300ml，上732树脂柱，水洗后用0.05M～0.40M的NH₄Cl洗脱，分别收集¹⁵N-L-酪氨酸和¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸单斑，浓缩后再上柱除盐，洗脱得到各自的洗脱液；经赶氨浓缩，活性炭脱色后，用乙醇和水进行结晶；结晶液冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于50℃～60℃真空烘干；对产品进行纯度、丰度检测，纯度＜98.5％可再行重结晶，最终得到¹⁵N-L-酪氨酸产品及回收的¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的微生物为能产天冬氨酸转氨酶的菌类。

3.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的菌包括ATCC8739、ATCC11303、ATCC950。

4.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、含这些糖的糖蜜、淀粉；所述的氮源包括氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵、氨水，无机物以及酵母提取物、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏的一种或多种；所述的无机物包括磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸锰、硫酸铜的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的发酵培养条件：pH值最好是6.5～8.5，转速最好是以180～220rpm，温度优选35℃～39℃。

6.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的磷酸吡哆醛溶液的浓度为1mmol/L～5mmol/L。

7.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的底物为4-羟基苯丙酮酸，底物溶液中所用的¹⁵N氮源为¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸，作为氨基供体。