[发明专利]多功能纤维素酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域。更具体地，本发明涉及一种新的多功能纤维素酶、编码该酶的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种酶的方法。本发明还涉及含该多功能纤维素酶的载体和宿主细胞及其在生产简单糖和葡萄糖方面的用途。

背景技术

自上世纪七十年代能源危机以来，国际油价屡创新高，人们逐渐开始寻找新的可再生燃料来代替石油，燃料乙醇被视为最有可能替代汽油的可再生能源之一，而其中纤维乙醇燃料的应用前景被广泛看好。

植物干物质主要由纤维素和半纤维素构成。纤维素是自然界最丰富的可再生的能源。将未经任何化学处理的纤维素生物转化成简单糖或葡萄糖，作为发酵碳源生产酒精，是最理想和有效利用天然纤维素资源的方法之一。

纤维素酶是指能将纤维素水解为葡萄糖等简单糖类的一类酶系。通常认为生物转化纤维素生成葡萄糖至少需要三种不同酶的协同作用：(1)葡聚糖外切酶(exo-β-1，4-glucanase，E.C.3.2.9.11)，也称外切纤维素酶(exocellulase)、外切葡聚糖酶(exoglucanase)、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)，作用于纤维素分子非还原末端水解β-1，4-糖苷键生成纤维二糖和葡萄糖；(2)葡聚糖内切酶(endo-β-1，4-glucanase，E.C.3.2.1.4)作用于纤维素非结晶区随机水解β-1，4-糖苷键生成带非还原端的较短的寡聚糖；(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucanase，E.C.3.2.1.21)将纤维二糖水解为葡萄糖。纤维素的水解反应需要上述三种组分协同作用才能有效地进行。

在半纤维素的各种组分中，木聚糖所占比例最大，因此，木聚糖水解酶(木聚糖酶)也是目前研究最多的半纤维素酶。木聚糖酶同样也是由多种水解酶组成的酶系。其中，最重要的是内切-β-1，4-木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase，E.C.3.2.1.8)和β-木糖苷酶(β-xylosidase，E.C.3.2.1.37)。

目前，研究较为集中的是真菌和细菌的纤维素酶系。丝状真菌中的李氏木霉(T.reesei)和绿色木霉(T.viride)以及热纤梭菌(C.thermocellum)和cellulomonas fimi等物种的纤维素酶系较复杂，有多种亚类的内切酶，外切酶及葡萄糖苷酶[Thomas M.Wood，Biochemical.Society Transactions.1992，20，46-53]，例如绿色木霉有6种亚型的内切酶[Beldman，G.et al  Eur.J.Biochem.1985，146：301-308]。热纤梭菌的纤维素酶需要同多个蛋白质形成分子量巨大的纤维体(Cellulosome)才能起催化反应[Felix C.R and L.G.Ljiungdahl，Annu.Rev.Microbiol.1993，47：791-819]，显然这样复杂的酶系必然会给研究和应用带来极大的困难。另一方面，纯化的单一组分的内切酶和外切酶要么不能水解未经化学处理的天然纤维素生成简单糖，要么水解活力极低，如李氏木霉(T.reesei)的纤维素酶系统中至少需14类纤维素酶的协同作用才能水解将未经化学处理的植物纤维。

传统的观点认为动物没有自己的纤维素酶系，需依赖共生菌的纤维素酶将纤维素水解成单糖，供生命活动需要。但是90年代末发现了白蚁和小龙虾内在的纤维素内切酶[Hirofumi，W.Gaku，T，nathan，L Nature，1998，394：330-331；Keren A.B.et al.Gene，1999，239，317-324]。此外，在拟南芥中也发现了12种内切酶基因[del Compillo，Curr.Top.Dev.Boil.1999，46：39-61]。

近年以来，在其他微生物(细菌、放线菌、真菌等)、昆虫、植物、动物中相继发现了纤维素酶基因。把这些基因克隆到细菌、酵母或昆虫细胞中来构建新的纤维素表达系统成为获得高的纤维素酶产量和活性的方法之一。

在地球上每年由固定CO₂的光合作用就能形成100亿吨以是上的干植物物质，其中这些物质的组成一半以上是由纤维素，其次是半纤维素(主要由木聚糖所构成)。如果再加上人类活动所造成的废弃的纤维素，如稻草，麦秸等，其存在量则要以天文数字来计算。如何采用生物技术综合利用植物干物质或废弃的纤维素的问题上，纤维素酶和木聚糖酶(半纤维素酶)起着关键作用。有效地将这些天然的纤维素转化为简单糖是纤维素作为再生能源的关键。