[发明专利]一种高效检测临床样品中结核分支杆菌复合体的方法

权利要求书

1.一种快速、有效液化痰的方法，根据该方法配制的液化试剂适用于结核病等呼吸道疾病的痰样品前处理，它包括步骤：在临床检测的痰样品中直接添加1～5倍体积的液化试剂，旋涡振荡器上振荡混匀30s～1min，室温静置15～20min，3000g～4000g离心15min，弃上清，沉淀用于下一步的核酸提取。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，根据所述的方法配制的液化试剂，其成分选自下组：0.5～1％的西吡氯铵，10～40％Na₃PO₄，0.1～5％的NALC，5～500mg/ml的溶菌酶，0.01～5％的DTT，5～500mg/ml的蛋白酶K，1～40％的NaCl，1～10％柠檬酸三钠，0.001～1％NaN₃以及它们的混合物。

3.一种结核分支杆菌复合体荧光PCR扩增检测方法，它包括步骤：在特异性扩增条件下，在荧光PCR扩增反应体系中进行PCR扩增反应和实时荧光检测，检测的荧光信号强弱与PCR产物的数量呈正比，反应结束以后通过设定荧光阈值来判定扩增产物是否存在，其特征在于，所述的反应体系中含有特异性扩增结核分支杆菌复合体核酸的引物对，还含有结核分支杆菌复合体特异性荧光探针。

4.一种检测结核分支杆菌复合体的遗传标记物，其特征在于，它具有SEQ ID NO：1中连续的80～300个核苷酸。

5.如权利要求3所述的方法，所述的特异性扩增结核分支杆菌复合体的引物对选自下组：

引物1：5’-CTA CGC AGC AGA TCC CCA-3’，SEQ ID NO：2

引物2：5’-GCA CCG CCC AAC TCG TT-3’  SEQ ID NO：3

引物1序列与SEQ ID NO：1所示的序列相同，引物2与SEQ ID NO：1所示的序列互补。

6.如权利要求3所述的方法，所述的结核分支杆菌复合体特异性荧光探针具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。该探针是Taqman探针，并且可发出不同波长荧光。

7.一种高效检测临床样品中结核分支杆菌复合体核酸的检测方法，该方法将权利要求1所述的方法与权利要求3所述的方法结合并贯彻实施，包括以下步骤：

(1)痰样品液化；

(2)样品DNA提取；

(3)以抽提的DNA为模板，在荧光PCR扩增反应液中加入所述的特异性扩增结核分支杆菌复合体的引物对和所述的结核分支杆菌复合体特异性荧光探针，进行荧光PCR扩增反应；

(4)结果分析，反应结束以后通过设定荧光阈值来判定扩增产物是否存在，存在扩增产物就表示样品中存在结核分支杆菌复合体。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：含相同数量卡介苗菌的模拟临床痰样品与卡介苗稀释菌液经痰液化以后作核酸提取和荧光PCR扩增检测，结果显示两份样品的C_t值相差小于1，表明虽然痰样品经过液化步骤但是其中结核分支杆菌DNA没有损失。卡介苗用1ml灭菌双蒸水溶解，依次作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释，10^-2、10^-3、10^-4稀释的100μl卡介苗菌液添加到1ml健康人痰作为模拟临床样品，与10^-2、10^-3、10^-4稀释的100μl卡介苗菌液的检测结果对照。