[发明专利]血管生成抑制因子的制备方法

权利要求书

1.一种血管生成抑制因子的制备方法，其特征是先将赤魟软骨粉碎，再经抽提、粗分、纯化，最后脱盐，冷冻干燥，获得赤魟软骨血管生成抑制因子，其英文缩写名记为DCAIF-I，其中

抽提是：先将粉碎的赤魟软骨按1∶4-6的比例放置于抽提液中，该比例为重量与体积比，单位是g∶mL，所说抽提液中含0.05-0.1mol/L的MES、重量/体积百分比为0.02％的EDTA和1.0-2.0mol/L的盐酸胍，随后将pH值调至5.4-6.2，于15-30℃下振荡72h，再于4℃下，10000r/min离心，弃残渣，得上清液为赤魟软骨抽提液；

粗分是：先将赤魟软骨抽提液经超滤获取分子量在3-200KD的赤魟软骨血管生成抑制因子粗提液，再将赤魟软骨血管生成抑制因子粗提液用丙酮作分级沉淀，获得的沉淀以pH值为7.0-7.6、浓度为0.02mol/L的Tris-HCl缓冲溶液进行透析，再经冷冻干燥获得赤魟软骨血管生成抑制因子粗制品；

纯化是：取血管生成抑制因子粗制品先用Hitrap 26/10 Desalting柱进行脱盐，再用Hitrap DEAE FF离子交换柱进行层析，获得10个明显的分离峰，收集第1峰；再用Superdex75 10/300GL柱进行层析，获得4个明显的分离峰，收集第1峰；再用Shim-pack VP-ODSHPLC柱进行层析，获得3个明显的分离峰，收集第1峰。

2.如权利要求1所述的血管生成抑制因子的制备方法，其特征是在抽提时，所说的于4℃下，以10000r/min离心，弃残渣分为两步，即是先在4℃下，以10000r/min离心25min，弃残渣，再以上清液继续在4℃下，以10000r/min离心25min，再弃残渣。

3.如权利要求1所述的血管生成抑制因子的制备方法，其特征在粗分时，所说的用丙酮作分级沉淀是用一级浓度在20％-80％之间的不同浓度的丙酮溶液对赤魟软骨血管生成抑制因子粗提液进行分级沉淀，并将所有沉淀进行合并后作透析。

4.如权利要求1所述的血管生成抑制因子的制备方法，其特征在纯化是时，用HitrapDEAE FF离子交换柱层析的洗脱速度为3-6ml/min；用Superdex 75 10/300GL柱层析的洗脱速度为0.5-1.2ml/min；用Shim-pack VP-ODS HPLC柱层析的洗脱流速为0.5-1.2ml/min，其中流动相为35％～50％  乙腈+0.05％TFA。