[发明专利]一种均相荧光免疫检测领域新型荧光物质组合技术

说明书

技术领域：

荧光免疫检测技术

技术背景：

均相荧光免疫检测法(homogeneous fluroimmunoassay，HFIA)是基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理发展的一种新的免疫检测技术。常用的方法是用二个荧光物质分别标记同一抗原的二个抗体，其中一个荧光物质(供体)的发射光波长与另一个荧光物质(受体)的激发光波长相互重叠。当同把二个荧光标记抗体加入到反应液中，用双抗体夹心法检测待测抗原。如果待测样品中含有目的抗原，会发生抗原、抗体反应，形成抗原、抗体复合物，供体荧光物质与受体荧光物质紧密接触。这时采用荧光检测仪或时间分辨荧光检测仪检测反应液荧光信号，用短波长紫外光激发供体荧光，就会发生FRET。供体发射的荧光能进一步激发受体分子发射出更长波长的荧光。这样不仅可以增强荧光信号，并且可以降低背景荧光，减少非特异性荧光的干扰，显著提高信噪比。这是因为，(1)供体产生荧光后，再激发受体产生荧光，有放大荧光信号的作用。(2)受体荧光一般波长较长，多为红光或红外光。而样品中本底荧光物质在受到紫外光激发后波长位移没有这么大，多为绿色光和黄色光，并会迅速衰减。因此，长波长荧光信号不受非特异性荧光的干扰，信噪比较高。此外，均相免疫检测法是在抗原、抗体反应后，直接检测反应液的荧光信号，省却了酶联免疫检测法(ELISA)需要反复孵育和洗板等烦琐的操作步骤，也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，操作简单，检测时间短，稳定性和重复性较好，能较真实地反映被测物质的含量。

传统的荧光染料激发光和发射光波长之间的Stokes位移较小，仅有30-80nm，常有部分重叠，较易受到非特异性荧光干扰。现在荧光FRET技术通常采用镧系元素铕(Eu)、锝(Tb)等作为供体荧光材料，激发光波长和发射光波长之间Stokes位移较大，超过250nm，如Eu的激发波长为340nm，最大发射波长为615nm，二者相差290nm，激发光谱和发射光谱没有重叠，可避免非特异性荧光的干扰。镧系离子螯合物经紫外光激发后不仅强度高，而且半衰期长(比普通的荧光物质半衰期长5-6个数量级)，稳定性好(低温条件可保存三年)，非常适合于抗原、抗体标记，因而成为二十一世纪最热门的荧光材料。

在均相荧光免疫检测技术中，通常将标记抗体的荧光物质制备成纳米颗粒。然后再标记相应的抗体或抗原。这样，既可以减少荧光物质的泄漏，也可以增强荧光物质的稳定性。当抗原、抗体发生反应形成抗原、抗体复合物时，荧光纳米颗粒紧密接触，在受到激发光刺激后，通过纳米颗粒间发生的FRET，显著增强荧光信号。这种技术目前广泛应用于蛋白或半抗原的免疫荧光检测或制备微型生物传感器。

目前，均相荧光免疫检测技术常用的荧光物质配伍组合是铕(Eu)或锝(Tb)与Cy5、Cy3或藻红蛋白等组合方式。Eu的最大激发光为340nm，最大发射光为615nm，Cy5的最大激发光为643nm，最大发射光为670nm。Eu发射光与Cy5发射光之间仍有部分重叠，本底荧光还比较高，影响均相荧光免疫检测的灵敏度和信噪比。

参考文献：

1.Leena Kokko，et al.Europium(III)chelate-dyed nanoparticles as donorsin a homogeneous proximity-based immunoassay for estradiol.AnalyticaChimica Acta(2004)，503：155-162

2.Kimura H，et al.Rapid and simple quantitation of methamphetamine by usinga homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay based on fluorescenceresonance energy transfer from Europium to Cy5.J.of AnalyticalToxicology.2005；29：799-804

3.Lovgren T，et al.One-step all-in-one dry reagent immunoassays withfluorenscent erupium chelate label and time-resolved fluorometry.Clinical Chemistry，1996，42(8)：1196-1201