[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征－安卡拉牛痘病毒基因工程疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地是涉及基因工程疫苗，特别涉及猪繁殖与呼吸综合征疫苗。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征的病原，主要表现为妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸症状和高死亡率。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来，现已遍及世界各主要养猪国家及地区，并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。PRRS的预防与防治主要依靠疫苗的接种。目前用于PRRS预防与防治的商用疫苗主要有弱毒疫苗和灭活疫苗。但已证实弱毒疫苗存在散毒及高几率毒力返强的安全隐患，国外许多国家已禁用弱毒疫苗。灭活疫苗虽然安全性好，但不仅需要多次重复接种，而且免疫效果不理想，还经常可以导致免疫失败。因此，迫切需要研制出更安全、高效、廉价的新型疫苗来预防与防治PRRS。

PRRSV是有囊膜的单股线性正链RNA病毒，其基因组全长约15kb，包括9个开放阅读框(ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7)(Deas et al，J Clin Microbiol，1996；Snijderet al，J Gen Virol，，1998)其中有ORF5编码的GP5蛋白具有最强的中和病毒能力(Pirzadeh et al，J Gen Virol，1997，1998；Zhang et al，Vet Microbiol，1998；Weiland et al，Vet Microbiol，1999)，GP5是目前构建PRRS重组病毒弱毒活疫苗和DNA疫苗的最佳候选基因。

Ostrowsi等(J Virol，2002)在GP5暴露在囊膜表面的N-端鉴定了2个抗原表位，即表位A和表位B。表位A为A²⁷V²⁸L²⁹N³⁰，在诱导GP5的抗体上，A表位占主导地位，它通过抑制与其相隔仅7个氨基酸的中和性表位B被动免疫系统的识别，使免疫系统只产生针对表位A的非中和抗体，导致免疫后3周内猪血清内针对GP5的抗体是抗A表位的非中和抗体；而B表位由第37-45位连续的9个氨基酸残基组成(抗体主要识别H³⁸I⁴³Y⁴⁴N⁴⁵)，它所诱导的中和抗体出现较晚，感染后(4-6周)才能检测到针对B位点的中和抗体，由此可见，A表位与PRRSV中和无关，在猪被PRRSV感染期间，抗GP5的抗体主要是针对A表位的非中和抗体，并将抗表位B的中和抗体的产生推迟至少3周，构建新一代PRRSV疫苗，表位A的存在是有害无益的，因此去除A表位抑制中和抗体的作用同时增强B表位产生中和抗体能力的工作是非常有必要的。

经改造的安卡拉牛痘病毒(Modified VV Ankara，MVA)是将牛痘病毒Ankara株经鸡胚成纤维细胞传570代后得到的。MVA属于生物安全I级，作为疫苗载体有以下几点优点：(1)可以携带较大的外源基因；(2)在人类和哺乳动物细胞中可以高表达重组蛋白；(3)引起较强的体液免疫和细胞免疫；(4)冷冻及冻干保存具有较长的稳定性。鉴于MVA的以上优点，将其作为疫苗载体携带PRRSV的GP5-BB，制成基因工程疫苗。

发明内容

本发明的任务是：采用安卡拉牛痘病毒作为载体，分别与猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、GP5-DB基因重组得到DNA疫苗，目的是能达到理想的免疫效果，制备新型的基因工程疫苗。

实现本发明的技术方案是：

(1)从天然猪繁殖与呼吸综合征病毒中PCR扩增GP5基因，此处的猪繁殖与呼吸综合症病毒来源于Liboratorios Hipra公司生产的PRRS弱毒疫苗。

(2)将天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因采用猪偏爱密码子将其核苷酸序列优化，并采用基因合成仪合成优化的序列GP5A，本处所述的优化是指用猪偏爱密码子替换猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因原有的密码子。

(3)利用PCR将优化GP5基因中的表位A替换为猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的表位B，新合成的基因称为GP5-DB基因。

(4)将GP5和GP5-DB基因克隆到真核表达载体JN-2中，本处的真核表达载体JN-2由本实验室构建(见图十八)。

(5)将构建的JN-2-GP5和JN-2-GP5-DB质粒与安卡拉牛痘病毒重组。