[发明专利]高免疫原性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及表达猪繁殖与呼吸综合征病毒E、M蛋白的GP5和GP6基因的核苷酸序列。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的严重危害养猪业的传染病之一。目前用于预防PRRSV的主要有灭活苗和弱毒苗，但存在免疫保护效果不好或散毒等危险，因此迫切需要更安全、更有效的新型疫苗。

PRRSV是有囊膜的单股线性正链RNA病毒，其基因组全长约15kb，包括9个开放阅读框(ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7)(Deas et al，1996；Snijder et al，1998)其中由ORF5编码的E蛋白和由ORF6编码的M蛋白为PRRSV的主要结构蛋白，E蛋白和M蛋白可以二硫键相连的异源二聚体存在于PRRSV病毒粒子表面，是PRRSV病毒侵入靶向组织和细胞的必要条件(de Vries et al，1995；Mardassi et al，1996)，E蛋白诱导的抗体具有最强的中和病毒能力(Pirzadeh et al，1997，1998；Zhang et al，1998；Weiland etal，1999)，M可以诱导细胞免疫。因此GP5、GP6成为研制猪繁殖与呼吸综合征疫苗的主要候选基因。目前试验研究表明，利用天然的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、GP6基因构建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠或猪均能产生一定水平的中和抗体和细胞免疫，但普遍存在免疫水平较低，不能有效预防猪繁殖与呼吸综合征之不足。

发明内容

本发明的任务是提供一种经人工改造的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因，使其具有较高的免疫原性之特点，从而为制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗提供更好的抗原基因。

实现本发明的方案是：对表达猪繁殖与呼吸综合征病毒E、M蛋白的GP5和GP6基因的核苷酸序列进行改造，以提高二者的免疫原性，达到更好的免疫效果。利用本发明提供的抗原基因制备的疫苗将用于本体动物猪体内，故本发明是在保证猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因所表达蛋白的氨基酸序列不变的前提下，用猪的偏爱密码子替代猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、GP6基因的天然密码子。具体技术方案是：在保证猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6蛋白氨基酸序列不变的前提下，采用猪偏爱密码子替代天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因的相应密码子，从而改造天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因，并采用基因合成仪合成改造后的基因，以便将其用于制备猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、GP6的DNA疫苗。

实施本发明的具体步骤是：用猪偏爱密码子替代天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因的相应密码子改造天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因，并采用基因合成仪合成改造后的基因(命名为GP5A和GP6A)。

将改造后的GP5A和GP6A基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1和JN-1中构建DNA疫苗，(JN-1质粒的酶切图谱见图16，JN-1的构建是在pCI-neo的基础上改造其多克隆位点和复制原点而成)。用构建的pcDNA3.1-GP5A、pcDNA3.1-GP6A、JN-1-GP5A和JN-1-GP6A的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA及病毒微量中和试验检测其免疫效果。

本发明将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因和GP6基因改造为在猪体内具有更强免疫效果的优化基因，并证实在BALB/c小鼠体内其具有优良的免疫原性，从而为制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗提供了更好的抗原基因。

经实验证实：与现有技术相比，改造后的GP5A和GP6A基因所诱导的ELISA抗体有明显提高；所产生的中和抗体的效价有显著提高，表明本发明提供的改造后的GP5A和GP6A基因具有高免疫原性。

附图说明

图1为天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因序列；

图2为利用猪偏爱密码子替代天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因相应的密码子改造得到的GP5A序列；

图3为天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP6基因序列；

图4为利用猪偏爱密码子替代天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP6基因相应密码子改造得到的GP6A序列；

图5为GP5A PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DL2000Marker，1为GP5A序列片断；