[发明专利]诱变方法

说明书

[001]本发明涉及产生诱变的核酸分子的方法。特别地，本发明涉及这样的方法中，在该方法中，诱变反应中使用的引物(诱变引物)本身是从模板核酸分子合成的。诱变反应的产物是诱变的环状核酸分子，其能例如在不需要其它修饰的情况下，被转化进入细菌。在优选的实施方式中，本方法被运用于分子群，例如用于分子群的产生和筛选中。本方法也以组合方式被使用，在其中，多种诱变引物用于突变多种亲代分子。

[002]涉及分子生物学技术的其中一个步骤是引导核酸分子进入载体。例如，DNA片段或DNA片段群可以被消化，并通过连接反应被引入载体。例如，DNA片段(或片段群)可从第一个载体(例如，质粒)消化并除去，利用已知的亚克隆方法进入第二个载体。这样，第一载体使用和第二载体相同的限制性内切酶进行消化，以致生成用于连接的互补的突出端。然后，DNA片段和第二载体依靠其互补的突出端进行连接，结果得到包含所述DNA片段的完整的载体，其能在宿主细胞中(例如，在细菌中)复制。

[003]因此，可以产生大量的DNA以用于多种分子生物学应用。或者，已引入DNA的载体可具有特定的目的(例如可以是表达载体)。一旦被引入这样的表达载体，限制性片段编码的蛋白质可从宿主细胞中的载体表达。一旦表达，所产生的蛋白能被纯化以用于其最终用途。或者具体地，当本方法用来将DNA片段群引入表达载体时，表达的蛋白可用于筛选(例如，通过对靶分子的结合亲和力)。

[004]引导突变进入DNA的多种方法也是已知的。从Barik的研究中已知，用基于PCR的方法引导突变进入线性DNA(Barik，Methods in Molecular Biology Vol.192：PCR Cloning Protocols，2^nd edition p189-196，Eds B-Y Chen and H. W Janes @Humana Press Inc，Totowa，NJ Burke and Barik，Methods in Molecular Biology Vo.226：PCR Protocols，2nd Edition p 525-531，Eds JMS Bartless and D Stirling @Humana Press Inc，Totowa，NJ)。依照这些方法，在PCR反应中所谓的大引物(megaprimer)已被用于引导突变进入线性模板。然而，这些方法导致线性双链DNA产物，为了产生用于例如放大(scale up)或者用于蛋白质表达的复制型，这些产物本身必需被亚克隆入适当的载体。

[005]Miyazaki提出了一种涉及全质粒PCR的方法(Miyazaki，Methods inMolecular Biology：Directed Evolution Library Creation：Methods and Protocols.EdsArnold and Georgiou，Humana Press Inc.Totowa，NJ；BioTechniques 33：1033-1038)。在这种方法中，双链质粒在PCR反应中被用作模板，并将包含将被引入的突变的双链PCR产物加入到该PCR反应用于引发PCR反应。然而，引物和模板的双链性能引起引物链和模板链自退火而不是交叉退火，因此使用特定的引物与模板比率以使自退火现象最小化。

[006]除了由双链模板导致的自退火的问题以外，当双链模板用于PCR反应时，还有进一步的问题。在指数反应中，当在一轮中引入的错配在指数基础上被携带入随后的每一轮中时，引入错配的容量是巨大的。而且，这里PCR模板是大模板例如载体，诸如质粒，这进一步增加了引入错配的可能性。

[007]使用合成的寡核苷酸去突变DNA也是已知的(Kunkel et al.，(1985)PNAS USA，Vol 82，pp 488-492；Sidhu et al.，Phage Display for the Selection of NovelBinding Peptides)。但是，能被化学合成的寡核苷酸的长度是有限制的。另外，为了使合成仪程序化，序列必须是已知的并且预先输入到合成仪中以用于其产生。

[008]因此需要可选的诱变方法。特别地，需要产生能直接被转化入细菌的产物的方法，准备用于下游，例如用于表达筛选中(避免需要另外的消化和连接步骤来将核酸引入恰当的载体)。也需要快速、有效的诱变方法以及可经改良用于扩增的方法，例如用于产生筛选或产生文库的群。