[发明专利]分析方法

说明书

本发明涉及分析血液中高半胱氨酸的方法和用于这种方法的分析试剂盒。

高半胱氨酸(HCy)是小的含硫α氨基酸，不用于蛋白质合成，但以低浓度存在于细胞和细胞外液中，例如在成年人血浆中一般约10μM。提高的血浆HCy水平与叶酸或维生素B缺乏以及与心血管疾病相关。因而在分析血浆中的HCy中存在着重要临床意义。

由Axis-Shield ASA开发了一种这样的分析系统，可以从AbbottLaboratories商业地获得。在销售的前六年中，已经使用这个系统进行了超过2600万这种HCy分析。Axis-Shield/Abbott HCy分析包括将血浆中的HCy酶转化成S-腺苷基-高半胱氨酸(SAH)和对SAH的免疫分析检测。然而Axis-Shield/Abbott HCy分析被设计在临床实验室中进行，仍然需要一种HCy分析，其是即时(point-of-care)可进行的形式，例如，在医师的办公室中进行，使得患者不必重新访问来获知分析的结果。

能够在即时使用的分析执行设备近来已经由Axis-Shield ASA开发。这是可以商业上获得的(商标Afinion)，并在例如WO 02/090995中进行了描述，在此引用其内容作为参考。在Afinion系统中，样品(例如，血液、血浆、尿，等等)被置于分析盒中，其含有预先加载了进行分析所需的试剂的几个孔，并带有计算机可读的信息，足以允许设备来确定对于特定的样品类型和目标被分析物如何进行分析。

我们现在已经开发了即时能够进行的血浆HCy分析，例如，使用Afinion设备，使用全血，即，不需要从血液样品分离细胞。

使用全血而不是血浆的能力大大地简化了医师所需的样品操作。

然而使用全血产生了关于血浆HCy分析性能的严重难题，因为样品中的细胞内HCy可能潜在地漏入血浆中。实际上，对于血浆HCy的当前的临床实验室分析，医师被指示从全血中分离血浆，并在30分钟内冷冻保存血浆样品，以避免被细胞内HCy污染。细胞内HCy造成的污染必需避免，因为正常/异常血液HCy的当前标准是对于血浆HCy的，还不知道患者之间在细胞内HCy中存在多少差异，以及根据患者的健康状况这种差异有多少。

然而，我们现在发现，通过延迟细胞裂解直到发生结合，并通过校正血细胞比容，有可能在血浆HCy的酶免疫分析中使用未分离的全血样品。

因而，从本发明的一个方面考虑，提供了分析采自人类或形成血管的非人动物受试者的血液样品中血浆高半胱氨酸的方法，所述方法包括：用以下试剂接触来自所述受试者的全血样品——液体稀释剂、还原剂、高半胱氨酸-转化酶、任选的所述酶的高半胱氨酸转化反应的抑制剂、细胞裂解剂、能够与所述高半胱氨酸转化酶的转化产物结合的颜色标记的结合剂，和能够与所述转化产物竞争与所述结合剂的结合的颗粒；在用所述试剂接触后，抽吸所述样品通过具有孔隙的膜，所述孔隙足以使所述结合剂在其未结合状态时和当与所述转化产物结合时通过，但不足以容许与所述颗粒结合时的所述结合剂通过；检测保持在所述膜上的所述结合剂的颜色标记；通过应用取决于所述全血样品中红细胞浓度的校正因子，由此确定血浆高半胱氨酸浓度的指标；以及任选的但是优选的，将所述血浆高半胱氨酸浓度表示为可视的或电子的信号；其中与所述试剂接触在如下情况下是相继的或同时的：

i)在与所述稀释剂、酶和还原剂接触后发生与所述裂解剂的接触；

ii)当抑制剂存在时，与抑制剂的接触发生在与所述稀释剂、酶和还原剂接触之后，但不晚于与所述裂解剂的接触；以及

iii)与所述结合剂和所述颗粒的接触不包括与含有所述结合剂和所述颗粒两者的液体接触。

在本发明的方法中，优选的是在细胞裂解开始前(或同时)采取步骤来终止或至少减慢高半胱氨酸转化酶的HCy转化。这可以通过改变样品温度，例如，来减慢酶反应或使酶变性，或通过稀释，或通过改变pH值，或通过添加用来抑制反应或使酶变性的试剂(例如，使用洗涤剂如SDS、离液盐例如NaSCN，或其他已知的变性剂，例如尿素或氯化胍(guanidiniumchloride)，或金属或辅助因子(co-factor)结合剂(其中所述酶反应需要金属或辅助因子))来实现。当使用变性洗涤剂时，这也可以起到裂解剂的作用。为了方便起见，干扰酶的HCy转化反应的这种试剂在此是指抑制剂，在本发明方法的优选的实施方式中，抑制剂被包含在一系列使用的试剂中。