[发明专利]耐抗病毒分子的乙型肝炎病毒的基因分型和表型方法

权利要求书

1.一种由患者的生物样本制备乙型肝炎病毒基因组扩增子的方法，该方法包括以下步骤：

a)从所述生物样本中提取乙型肝炎病毒核酸；

b)用引物对扩增所述乙型肝炎病毒核酸，选择该引物对以获得包括整个乙型肝炎病毒基因组的扩增子，该引物对包括限制位点的拷贝，所述限制位点在所有基因型的乙型肝炎病毒基因组的共有序列中不存在或只存在一次，其中，所述限制位点在限制酶的识别序列内被该限制酶切断；

c)用切断所述限制位点的限制酶消化所述扩增子；以及

d)选择性地，对消化的扩增子进行纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述引物包括与乙型肝炎病毒间隙区域互补的核苷酸序列，所述间隙区域由SEQ ID No.1的1800至1850的核苷酸位置确定。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述限制位点在所有基因型的乙型肝炎病毒基因组的共有序列中不存在，并且其中，所述限制位点基本上在所有乙型肝炎病毒序列中缺乏和/或不在乙型肝炎病毒基因组序列中引入多于3个核苷酸变化。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述限制位点选自由BssH II、Cla I、Mlu I、Nhe I、Not I、Pvul、Rca I、Sun I(BsiW I)和NarI所组成的组中。

5.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其中，所述引物包括NarI限制位点的核苷酸序列(SEQ ID No.41)以及与所述乙型肝炎病毒间隙区域互补的核苷酸序列。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述引物对选自由SEQ ID No.42和SEQ ID No.43、

SEQ ID No.44和SEQ ID No.45、

SEQ ID No.11和SEQ ID No.12、

SEQ ID No.14和SEQ ID No.15、

SEQ ID No.18和SEQ ID No.19、

SEQ ID No.22和SEQ ID No.23、

SEQ ID No.26和SEQ ID No.27、

SEQ ID No.30和SEQ ID No.31、

SEQ ID No.34和SEQ ID No.35、以及

SEQ ID No.38和SEQ ID No.39所组成的组中。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，所述引物对为SEQID No.42和SEQ ID No.43。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述引物对为SEQ ID No.44和SEQ ID No.45。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括步骤(e)，该步骤(e)包括将在步骤(d)中得到的所述扩增子克隆到原核载体或真核载体中，扩增该克隆的扩增子和/或选择病毒亚种群的扩增子，以及从所述载体中提取扩增的扩增子和/或选择的扩增子。

10.一种乙型肝炎病毒基因组扩增子，该乙型肝炎病毒基因组扩增子由根据权利要求1-9中任意一项所述的方法获得。

11.一种原核载体或真核载体，该载体包括根据权利要求1-8中任意一项所述的方法的步骤(d)中获得的扩增子。

12.一种对在患者的生物样本中存在的乙型肝炎病毒株系进行基因分型的方法，该方法包括对由根据权利要求1-9中任意一项所述的方法获得的扩增子进行基因分型的步骤。

13.一种测定可能在患者的生物样本中存在的乙型肝炎病毒株系的种群或者亚种群的复制能力和/或测定所述株系对能够干扰病毒复制的试剂的耐药性的方法，该方法包括如下步骤：

a)将由根据权利要求1-9中任意一项所述的方法得到的扩增子转染到允许乙型肝炎病毒复制的人源细胞中，选择性地在能够干扰乙型肝炎病毒复制的试剂的存在下；

b)选择性地，用DNA酶处理所述细胞；

c)培养所述细胞，选择性地用浓度增加的能够干扰乙型肝炎病毒复制的试剂，

d)提取由培养的细胞所产生的病毒DNA和/或蛋白；以及

e)对提取的病毒DNA和/或蛋白进行定量测定。