[发明专利]链球菌荚膜糖的偶联

说明书

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技术领域

本发明涉及将细菌荚膜糖与运载体偶联而形成糖偶联物(glycoconjugate)的领 域。糖偶联物可用于免疫接种。

背景技术

用细菌荚膜糖疫苗抵御有荚膜细菌已有多年。然而，由于糖是不依赖T细胞 的抗原，它们的免疫原性不佳。与运载体偶联(conjugation)能将不依赖T的抗原转 变成依赖T的抗原，从而增强记忆应答并产生保护性免疫力。因此，最有效的糖 疫苗以糖偶联物为基础，原型偶联疫苗能抵御乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(“Hib”)[例如，见参考文献78的第14章]。

报道已有偶联疫苗的另一种细菌是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，也 称为“B群链球菌”，或简称为“GBS”。Dennis Kasper及同事从事了该疫苗的 大部分工作，见例如参考文献1-9。GBS糖转化的Kasper方法通常包括还原胺 化纯化的糖与运载体蛋白，例如破伤风类毒素(TT)或CRM197[2]。还原胺化涉 及运载体中氨基酸侧链上的胺基与糖中的醛基。如图1所示，由于天然形式的 GBS荚膜糖不包含醛基，则应在用过碘酸盐氧化糖的唾液酸残基以产生醛基再 偶联[2，10]。

虽然以此方式制备的GBS各血清型(Ia、Ib、II、III和V)的偶联疫苗已显示 在人体内安全且有免疫原性[11]，但仍需要其它和更好的方法来制备GBS荚膜糖 偶联物。

发明内容

本发明依据三种偶联方法，采用这些方法可替代现有技术公开的直接还原胺 化，所有这些方法的目的在于(a)与现有技术相比，能使保留的唾液酸残基形式更 接近天然多糖所见的形式，和(b)可在偶联反应中用接头来提高与运载体的偶联。

■在第一种方法中，采用还原胺化已氧化的唾液酸残基侧链，但先胺化醛基， 再将该胺通过接头与运载体偶联。该方法描述于图2的“途径A”中。

■在第二种方法中，唾液酸残基和/或N-乙酰基-葡糖胺残基脱-N-乙酰化得到 胺基，将该胺基通过接头与运载体偶联。该方法描述于图2的“途径B”中。

■第三种方法是通过荚膜糖的半乳糖残基而不是唾液酸残基进行连接。该方 法可避免破坏唾液酸残基所形成的关键表位。

因此，在第一方面，本发明提供制备无乳链球菌荚膜糖与运载体分子的偶联 物的方法，包括以下步骤：(a)氧化无乳链球菌荚膜糖以在该糖的至少一个末端唾 液酸残基中引入醛基；(b)用氨或伯胺还原胺化该醛基得到-CH₂-连接的胺；(c)使 该-CH₂-连接的胺与双功能接头反应得到活化的糖；和(d)使该活化的糖与运载体 分子反应，从而得到偶联物。本发明也提供无乳链球菌荚膜糖部分通过接头部分与 运载体相连的偶联物，其中所述接头部分与荚膜糖部分中的唾液酸残基相连。

在第二方面，本发明提供制备无乳链球菌荚膜糖和运载体分子的偶联物的方 法，包括以下步骤：(a)使荚膜糖脱-N-乙酰化得到脱-N-乙酰化的荚膜糖；(b)使 该脱-N-乙酰化的荚膜糖与双功能接头反应得到活化的糖；(c)使该活化的糖与运载 体分子反应，从而得到偶联物。该方法可在步骤(a)和(b)之间包括使糖部分再-N-乙 酰化的步骤。

在第三方面，本发明提供制备荚膜糖和运载体分子的偶联物的方法，包括以 下步骤：(a)氧化荚膜糖在该糖的至少一个半乳糖残基中引入醛基，得到修饰的半 乳糖残基；和(b)将该修饰的半乳糖残基与运载体分子偶联。步骤(b)的偶联可以直 接进行，或经接头分子进行。本发明也提供荚膜糖部分通过接头部分与运载体相连 的偶联物，其中所述接头部分与该荚膜糖部分中的半乳糖残基相连。氧化半乳糖残 基特别可用于偶联无乳链球菌荚膜糖，但也适用于具有含半乳糖的荚膜糖的其它细 菌，例如脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(血清群W135)、霍乱弧菌 (Vibrio cholerae)(包括0139)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(包括 K21)、大肠杆菌(Escherichia coli)(包括K52)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(包括18C型)等。该方法也可用于含半乳糖的脂多糖和脂寡糖。当 半乳糖是糖的末端残基时，该方法特别有用。

荚膜糖