[发明专利]小干扰RNA和包含它的用于治疗乙型肝炎的药物组合物

说明书

技术领域

本专利申请要求提交于2005年3月9日的美国申请系列号60/660,132的优先权。本申请要求所列申请的权益，将其全文并入本文作为参考。

本发明涉及对乙型肝炎病毒X基因特异的小干扰RNA及其药用用途。

背景技术

估计全世界有超过3亿人被乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染。患有与HBV相关的肝衰竭的患者可能发展肝硬化或肝细胞癌。一种主要的抗HBV治疗是用α-干扰素或拉米夫定治疗，或用它们进行组合治疗。然而，α-干扰素作为抗病毒药物显示出一些缺陷，诸如药效低，副作用和昂贵的费用。拉米夫定，一种核苷类似物，是对HBV逆转录酶非常有效的和特异的抑制剂。但是，当在患者中停止治疗时，其导致对药物具有抗性的病毒基因组突变和对病毒复制的再次激活。仅有约20％的HBV患者对用α-干扰素和拉米夫定进行的组合治疗有反应。

HBV是一类小的被膜DNA病毒并且属于肝DNA病毒科(hepadnaviridae)。人的肝脏是HBV的主要的靶器官。HBV感染通常导致严重的肝衰竭，诸如慢性肝炎，肝硬化或肝细胞癌。HBV基因组是具有3.2kb的长度的部分双链环状DNA，其包含四个开放阅读框，称为S，C，P和X。基因组DNA的转录产生四种大小为3.5(前基因组RNA)，2.4，2.1，和0.7kb(信使RNAs)的不同的病毒RNAs。见图1(Ganem和Varmus，Annu.Rev.Biochem.，1987，56，651)。前基因组RNA不仅在病毒蛋白质翻译中而且在病毒DNA通过聚合酶蛋白的逆转录中都起着关键的作用。核心蛋白包装部分环状的DNA和聚合酶蛋白质，随后进行核壳体装配。接着，核壳体颗粒与病毒被膜蛋白质相互作用从而形成成熟的感染性病毒体，其在病毒生活周期的最后一个步骤从细胞中分泌出来。

HBV X(HBx)基因是最小的，长度为465个核苷酸，并且编码HBx蛋白质，所述蛋白质长度为154个氨基酸并且具有17kDa的分子量(Fujiyama et al，Nucleic Acids Res.，1983，11，4601)。它是多效的反式作用子，不仅刺激HBV的启动子和增强子，还通过蛋白质-蛋白质相互作用刺激广泛种类的其它病毒启动子(Nakatake et al，Virology，1993，195，305；Spandau和Lee，J.Virol，1988，62，427)。而且，HBx蛋白是通过与细胞转录因子的相互作用或通过信号转导途径诱导细胞转化和肝肿瘤的关键因素(Kekule等，Nature，1993，361，742)。因为HBx蛋白质涉及HBV-介导的HCC，其编码区包含在所有的四种HBV mRNAs中，并且在广泛种类的HBV亚型中是高度保守的，因此HBx基因对于设计和开发抗-HBV siRNAs一定是理想的靶标。

病毒生活周期可以通过HBV基因组质粒(gene-bank登记号M38636的adr亚型)，pcDNA-HBV1.3的转染引入病毒复制系统来人工地起始和增殖。见图2。通过改进以前报道的方法(Guidotti等，J.Virol，1995，69，6158)来发展pcDNA-HBV1.3克隆。HBV基因组质粒的转染导致体外病毒RNAs和蛋白质的表达。还可以应用其来构建体内小鼠模型系统，其中通过将携带HBV基因组的裸质粒DNA流体动力学注射到小鼠的尾静脉中来实现完全的免疫应答和病毒的复制以及成熟病毒颗粒的装配。这是通过实验模拟和诱导病毒复制周期并通过检测病毒蛋白质或观察病毒核酸来监测抗病毒药物的功效的有力的工具。例如，将HBV完整质粒和siRNA或其表达载体共注射导致在肝和血清中病毒抗原、转录物和复制DNA水平上的显著抑制(Giladi，Molecular Therapy，2003，8，769；McCaffrey，Nat.Biotechnol，2003，21：639)。

同时，RNA干扰(RNAi)是在进化上保守的进程，其中(内源和外源)基因表达在所有的真核生物中通过双链RNA(dsRNA)的引入而受到抑制。RNAi被称作切酶的RNase III-样核酸内切酶所起始，其促进长的dsRNAs连续切割为21-23nt的短的干扰RNAs(siRNAs)(Bernstein等，Nature，2001，409，363)。SiRNAs结合到RNA诱导性沉默复合物(RISC)中，其在ATP存在的情况下解开siRNA(Hammond，等，Nature，2000，404，293)。结合到RISC中的反义RNAs识别同源RNAs并且在细胞胞质区指导它们的降解。