[发明专利]通过引起RNA干扰的化合物治疗肠病症

说明书

发明领域

本发明涉及通过RNAi直肠内给药技术对肠疾病进行治疗的方法和组合物。本发明的组合物包括短干扰核酸分子(siNA)和相关的化合物，包括但不限于，小干扰RNAs(siRNA)。具体地说，本发明的组合物能够被用于肠疾病的治疗，其中包括：过度增殖性疾病，特别是结肠直肠癌；自身免疫和炎性肠病(IBD)，特别是局限性回肠炎；结肠炎，特别是溃疡性结肠炎；肠易激综合征；感染性肠疾病，例如假膜性结肠炎，阿米巴病或肠结核；结肠息肉；憩室病；便秘；肠梗阻；吸收不良综合征；直肠疾病和腹泻。

在某些实施方案中，由一种与1型辅助T(Th1)细胞免疫反应相关的细胞因子——白细胞介素-12(IL-12)水平的增高所引起的肠病症，例如自身免疫疾病和IBD，是用此方法来进行治疗的。本发明提供了治疗与IL-12过量表达有关的疾病的组合物和方法，特别是局限性回肠炎，其中包括siRNA和靶向IL12-p40亚基和/或IL12-p35亚基的相关化合物。

发明背景

以RNAi作为工具来调节基因的表达

RNA干扰是指由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。在20世纪90年代初期发现了植物具有此现象后，Andy Fire和Craig Mello证明了在Caenorhabditis线虫中dsRNA能够以一种非常高效的方式特异性地、有选择性地抑制基因的表达(Fire et al.，1998)。第一条链(有义RNA)的序列与目标信使RNA(mRNA)的对应区域的序列相一致。第二条链(反义RNA)与mRNA互补。这样形成的dsRNA证明比相应的单链RNA分子(具体地说，反义RNA)的效率高几个数量级。

RNAi过程起始于DICER酶与dsRNA相遇并将其切成称为小干扰RNAs或siRNA的片段。此蛋白质属于核糖核酸酶III核酸酶家族。蛋白质复合体将这些siRNAs聚集起来，并利用它们的编码作为指导去搜寻和破坏细胞中具有匹配序列的RNA，例如目标mRNA(见Bosher&Labouesse，2000；和Akashi et al.，2001)。

在应用RNAi进行基因击倒的尝试中，经过验证，哺乳动物细胞已经发展了多种抗病毒感染的保护机制，其可阻碍这种方法的使用。的确，极低的病毒dsRNA水平的存在触发一种干扰素的反应，导致全面非特异性的翻译抑制，进而触发调亡(Williams，1997，Gil&Esteban，2000)。

2000年，dsRNA被报道特异性地抑制小鼠卵母细胞和早期胚胎中的3个基因。翻译停滞，和从而引起的PKR反应，当胚胎继续发育时没有被观察到(Wianny&Zernicka-Goetz，2000)。Ribopharma AG(Kulmbach，Germany)的研究证明了哺乳动物细胞中RNAi的功能性，其功能在于利用短(20-24碱基对)dsRNAs切断人类细胞基因，而又不启动急性期反应。其他的研究小组也进行了类似的试验，并验证了这些结果(Elbashir et al.，2001；Caplen et al.，2001)。经过在人类和小鼠的多种正常和癌症细胞品系中的测试证明短发夹结构RNAs(shRNAs)能够和它们的siRNA负体同等高效率地使基因沉默(Paddison et al.，2002)。最近，另外一组小RNAs(21-25碱基对)被显示能够引起对基因表达的负调节作用。这些RNAs，即小时序控制的RNAs(stRNAs)，对Caenorhabditis线虫发育过程中基因表达的时间选择具有调节作用(关于综述参见Banerjee&Slack，2002；和Grosshans&Slack，2002)。

科学家们已经在一些系统中使用了RNAi，其中包括Caenorhabditis线虫，果蝇，锥体虫，和其它的无脊椎动物。几个研究小组近期提出了RNAi在不同的哺乳动物细胞系(特别是HeLa细胞)中对蛋白质生物合成的特异性抑制，从而证明了RNAi是一种可广泛应用的在体外使基因沉默的方法。在这些结果的基础上，RNAi已经快速地成为了一种著名的确认(识别和分配)基因功能的工具。使用短dsRNA寡核苷酸的RNAi有助于对仅被部分测序的基因功能的理解。

最近，Krutzfeldt和他的同事们的研究显示一类被称为antagomirs的特别设计合成的化合物能够有效地使微小RNAs(miRNAs)沉默，其中微小RNAs为控制基因表达的非编码RNA片段(Krutzfeldt et al.，2005)。