[发明专利]G－蛋白偶联受体配体

说明书

本发明涉及富含G-蛋白偶联类受体(GPCRs)中成员的激动剂和拮抗剂的化合物库的产生。

膜蛋白的G-蛋白偶联受体(GPCR)类中的成员(也称作七跨膜区或7TM受体和蛇形受体)介导细胞信号传导作为对极为广泛的各种胞外信号的反应，包括激素、神经递质、细胞因子且甚至是环境物质，诸如气味和味道。作为对与受体胞外部分(最常见的是受体蛋白的N-末端尾)的相互作用的配体的反应，受体暂时被转化成活化态(这种转化通常称作R+L→R*L，其中R为失活受体，R*为活化受体且L为配体)。

受体活化的(或R*)构象然后能够与G-蛋白家族中的成员发生相互作用。G-蛋白为结合鸟嘌呤核苷酸的三聚化胞内蛋白大家族。在与活化受体发生相互作用时(可能通过称作“碰撞偶联”的机理)，G-蛋白用结合的鸟苷二磷酸(GDP)交换鸟苷三磷酸(GTP)。在这种GTP-结合形式中，G-蛋白三聚体解离，产生游离的Gα亚单位和βγ二聚体。Gα和βγ亚单位随后可以参与进一步的信号传导级联。例如，Gα亚单位可以活化腺苷酸环化酶(AC)，该过程由腺苷三磷酸生成环腺苷酸(cAMP)。βγ亚单位可以活化PI-3-激酶家族酶中的成员。最终，这些信号可以导致对几乎细胞行为的每个方面进行调节，从收缩到运动，代谢到进一步信号传导。

一旦活化，则信号就通过许多机制缓慢停止。与Gα亚单位结合的GTP水解返回至GDP，导致Gα和βγ亚单位重新结合成失活的三聚化GDP-结合的G-蛋白。GPCR自身也在胞内C-末端上被磷酸化，从而防止与G-蛋白的进一步相互作用。最终结合的配体也可以解离。

这种属性的信号传导途径在哺乳动物生理学中是如此重要和遍在，以至于多至40％的得到许可的药物在其分子靶标中有GPCR。类似地，细菌已经进化至靶向G-蛋白信号传导，以便破坏宿主生理和免疫性：例如，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(导致霍乱的生物体)使得称作霍乱毒素的蛋白质不可逆地抑制广泛分布的称作G_s的G-蛋白Gα亚单位。类似地，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)(导致百日咳的生物体)使得称作百日咳毒素的蛋白质对不同的G-蛋白，G_i具有类似的作用。

鉴定调节GPCR信号传导的药物的一种手段在于筛选具有干扰配体结合包含重组或纯化GPCRs的膜制品的能力的极为广泛随机的化合物库。在这类高流量筛选中，已经采取了各种方法用于有利于检测结合。例如，在闪烁亲近测定法中，放射性配体与受体结合使得放射性核酸金属化物与结合受体的闪烁分子亲近-因为核酸金属化物衰变，所以发射可以检测和定量的光。或者，可以对配体进行荧光标记并且通过荧光偏振检测结合(在结合受体时固定配体时依赖于荧光标记旋转自由度的下降)。

尽管这些技术已经在某些情况中成功并且产生了随后研发为人用药物的前导化合物(例如5HT₃受体拮抗剂昂丹司琼，它用于治疗偏头痛)，但是尽管通过制药工业进行了深度筛选，然而对已经鉴定极少针对大量GPCRs的合适的非肽激动剂或拮抗剂化合物仍然存在需求(如果有的话)。例如，几乎没有对GPCRs家族趋化因子受体的非肽拮抗剂和无激动剂。因为趋化因子在免疫调节中起关键作用，所以预计这类分子为极为有价值的具有用于广泛具有炎症成分的疾病的免疫调节活性的药物。

两种因素限制了随机筛选程序可能的成功：首先，所筛选的化合物具有极大的空间间距，并且甚至使用最佳可利用的高流量技术和最佳组合化学技术手段才能生成不同的库，仅可以研究所有可能分子结构中的小部分。其次，甚至当已经成功地鉴定了前导物时，核心药效团通常不适用于体内-前导化合物及其类似物可能仅仅是毒性太大。

使用这类“负筛选”范例(其中你可以检测到测试库在阻断标记配体结合中的能力)的另一个主要问题大部分鉴定的前导物为受体拮抗剂。这些前导物中几乎没有任何激动剂活性(正如预计的-激动剂活性需要结合受体且然后将其转化成活化构象的能力，而激动剂仅主动需要结合受体或配体的能力，按照这类方式防止其相互作用)并且产生将其转化成激动剂的最初拮抗剂的类似物前导物为具有极低成功率的“击中和击不中”事件。

防止这一问题发生的一种手段在于用预选包含高比例GPCR结合化合物的分子结构库取代随机化合物库。这类库还理想地包含类似比例的激动剂和拮抗剂，以便它们易于定位。此外，理想的情况是，用于该库的基础分子结构为无毒性的。