[发明专利]原种事件A2704－12以及用于鉴定生物样品中此事件的方法和试剂盒

说明书

发明领域

本发明涉及用于鉴定生物学样品中存在包含特异性转化事件A2704-12的植物材料的方法和试剂盒，以及包含此事件的转基因大豆植物、植物材料和种子。本发明的大豆植物组合了除草剂耐受表型与农学性能、遗传稳定型以及对相当于在缺乏杂草压力下的非转化大豆品系的不同遗传背景的适应性。

发明背景

转基因在植物中的表型表达由基因自身构型及其在植物基因组中的位置两者决定。同时，转基因(在外源DNA中)存在于基因组中的不同位置会以不同方式影响植物的总体表型。在农业或工业上通过遗传操作成功地向植物中引入在商业上感兴趣的性状是一个依赖不同因素的复杂过程。遗传转化植物的实际转化和再生仅仅是一系列选择步骤的第一步，这一系列选择步骤包括广泛的遗传描述、培育和田地性状评估，最终选择出原种事件。

鉴于在Novel Food/Feed，segregation of GMO和non-GMO products和the identification of proprietary材料中的讨论，对原种事件的明确鉴定正变得日益重要。理论上，此鉴定方法既快又简单，无需广泛的实验室组织。此外，方法应该提供允许在无专家判读的情况下(根据需要，在专家审查时也有效)明确确定原种事件的结果。

在通过用包含合成的pat基因(编码对草铵膦(phosphinothricin)耐受)的质粒转化大豆来开发对除草剂Liberty具有抗性的大豆(Glycine max L.)的过程中作为原种事件选择出A2704-12，并且其可以作为Liberty Link大豆商业购买。本文描述了用于鉴定生物学样品中原种事件A2704-12的简单且明确方法中的工具。

发明简述

本发明涉及用于鉴定生物学样品中原种事件A2704-12的方法，其中该方法基于特异性识别A2704-125’和/或3’侧翼序列的引物或探针。

更加具体而言，本发明还涉及一种方法，其包括使用至少2个引物的聚合酶链式反应扩增生物学样品中存在的核酸序列，其中一个引物识别A2704-12的5’或3’侧翼区，而另一个引物识别外源DNA内的序列，以便优选得到100和500bp之间的DNA片段。引物可分别识别A2704-12 5’侧翼区(SEQ ID No.1中从位置1至位置209)或A2704-123’侧翼区(SEQ IDNo 2中从位置569至位置1000的互补序列)内的序列和外源DNA(SEQ IDNo 1中从位置210至位置720的互补序列或SEQ ID No 2中从位置1至位置568)。识别5’侧翼区的引物可包含本文所述的核苷酸序列SEQ ID No.4，并且识别外源DNA内的序列的引物可包含本文所述的核苷酸序列SEQ IDNo.8。

本发明更加特别地涉及用于鉴定生物学样品中原种事件A2704-12的方法，其中方法包括使用分别具有核苷酸序列SEQ ID No.4和SEQ ID No.8的两个引物的聚合酶链式反应扩增在生物学样品中存在的核酸序列，以得到约185bp的DNA片段。

本发明还涉及本文所述的A2704-12的特异侧翼序列，其可以用于开发特异性鉴定生物学样品中A2704-12的方法。更加具体而言，本发明还涉及A2704-12的5’和/或3’侧翼区，其可用于开发如本文进一步描述的特异性引物和探针。本发明还进一步涉及基于使用此类特异性引物或探针鉴定生物学样品中A2704-12存在的方法。由选自SEQ ID No 1中从核苷酸1至核苷酸209的核苷酸序列或SEQ ID No 2中从核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列的互补序列中的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列组成的引物与由选自SEQ ID No 1中从核苷酸210至核苷酸720的核苷酸序列的互补序列或SEQ ID No 2中从核苷酸1至核苷酸569的核苷酸序列中的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列的引物相组合。引物还可在其最3’末端包含这些核苷酸序列并且进一步包含无关序列或从所述核苷酸序列衍生但包含错配的序列。

本发明还涉及用于鉴定生物学样品中原种事件A2704-12的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个特异性识别A2704-12 5’或3’侧翼区的引物或探针。