[发明专利]用于去除所选择DNA序列的方法和手段

权利要求书

1.用于将目的DNA分子导入植物细胞或植物的基因组内，随后去除所述目的DNA分子的亚序列的方法，包括步骤：

a.将所述目的DNA分子导入所述植物细胞的基因组内，所述目的DNA分子包含侧翼为同向重复排列的两个DNA序列的所述DNA分子的所述亚序列并且还包含至少一个切点罕见双链DNA断裂诱导(DSBI)酶的识别位点，其中所述识别位点位于以同向重复排列的所述两个DNA序列附近，优选地位于它们之间；

b.选择在其中所述目的DNA分子整合进入基因组内的植物细胞并从所述植物细胞再生植物；

c.将所述植物与包含编码DSBI酶的嵌合基因的第二个植物杂交，其中所述嵌合基因包含如下有效连接的DNA区段：

i.小孢子特异性启动子；

ii.编码识别所述识别位点的双链DNA断裂诱导酶的DNA区域；

iii.转录终止和聚腺苷酸化区域；

d.选择包含所述目的DNA分子和编码DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物(F1植物)；

e.将所述后代植物与另一植物杂交，由此使用所述后代植物作为花粉供体；

f.选择包含编码DSBI酶的所述嵌合基因的后代植物的群体(F2群体)；和

g.选择在其中所述DNA分子的亚序列已经通过以同向重复排列的所述两个DNA序列间的同源重组被缺失的后代植物。

2.权利要求1所述的方法，还包括步骤：

h.将在其中所述DNA分子的所述亚序列已经缺失的所述后代植物与另一植物杂交；和

i.得到后代植物的群体(F3植物)并选择不合有编码切点罕见的DSBI酶的所述嵌合基因的植物。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述目的DNA分子的所述亚序列包含选择标记基因或筛选标记基因。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述DSBI酶是选自I-SceI、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-SceII、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfll I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-MthI、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-SspI、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I或PI-TspI的内切核酸酶或包含Zn指DNA结合结构域和DNA切割结构域的嵌合内切核酸酶。

5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述的DSBI酶是I-SceI。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中编码所述双链DNA断裂诱导酶的所述DNA区域包含SEQ ID No 1或SEQ ID No 2的核苷酸序列。

7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述的小孢子特异性启动子包含选自SEQ ID No 3的核苷酸序列的启动子片段或其功能性片段。

8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述目的DNA分子的所述亚序列侧翼为所述DSBI酶的两个识别位点。

9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中编码DSBI酶的所述嵌合基因包含SEQ ID No.6中从核苷酸1941至3913的核苷酸序列。