[发明专利]5－氟尿嘧啶耐受菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及下述菌的制备方法，所述菌可以用作实体肿瘤治疗药物，能够在厌氧环境下在肿瘤组织内生长，能够表达胞嘧啶脱氨酶(EC 3.5.4.1；以下称CD)，并且至少具有对抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶(以下称为5-FU)的耐受能力的表达CD的5-FU耐受菌。此外，本发明涉及5-FU耐受菌、含有该耐受菌的药物组合物、以及含有该耐受菌的实体肿瘤治疗药物。

背景技术

CD是使胞嘧啶脱氨化成为尿嘧啶的酶(例如，参见非专利文献1)。CD是在微生物的代谢中起着重要作用的酶，能够从多种不同的微生物中分离得到，不过在哺乳动物细胞中通常不产生这种CD(例如，参见非专利文献2)。产生CD的多种细菌以及真菌将5-氟胞嘧啶(以下称为5-FC)转换成对细胞有致死性的具有极强毒性的的代谢物5-FU。5-FU导致生成异常的RNA以及抑制DNA合成，5-FC的抗真菌作用正是通过这种5-FU的导致异常RNA生成和抑制DNA合成的作用。

即，5-FC通过胞嘧啶透性酶而被摄取到真菌细胞内，在细胞内5-FC经由CD直接转换成5-FU。细胞内的5-FU由5-FUMP在UMP-焦磷酸化酶的作用下转换成5-FUDP。此外，其在先的磷酸化途径分成两条，一条生成5-FUTP，另一条生成5-FdUMP。此处，5-FUTP代替UTP，通过被掺入到RNA中，生成异常的RNA，抑制正常的蛋白质合成，结果抑制真菌的生长。另外，5-FdUMP作为胸腺嘧啶酸合成酶的有力的抑制剂而发挥作用，抑制DNA合成、核分裂，展示出杀菌效果。

不过，因为正常的哺乳动物细胞不表达有意义量的CD，所以不能将5-FC脱氨为有毒的代谢物5-FU，所以5-FC即使达到表现出强的抗菌活性浓度也对哺乳动物细胞无毒。另一方面，5-FU对哺乳动物细胞具有强的细胞毒性作用，作为抗癌制剂而广泛使用。

从大肠杆菌(Escherichia coli)和酵母菌(Saccharomycescerevisiae)分离、克隆出CD基因(例如参见非专利文献3、4)。并且，多个研究人员通过将该CD基因导入到哺乳动物细胞，在体外试验中，这些细胞表示出对5-FC的选择性敏感度降低(例如参见非专利文献3、5)。此外，使用了逆转录病毒载体而将CD基因导入其中的肿瘤细胞在体内表现出能够通过5-FC的动物的全身治疗而被排除(例如参见非专利文献6～8)。此外，复制缺陷的腺病毒载体(例如参见非专利文献9)以及阳离子性脂质体(例如参见非专利文献10)或者分别向人大肠癌细胞以及小鼠的巨大细胞肺癌中导入CD基因而加以利用。通过在这些肿瘤细胞内进行基因表达而赋与对5-FC的敏感度。

已知在念珠菌(Candida)等真菌感染症中使用的5-FC容易获得耐受性(例如参见非专利文献11)。因为对5-FC的耐受性是由于与向5-FU转换、向RNA掺入等相关的任何的酶的丧失或者突变引起的，因此认为理论上有多种耐受性机制。在临床上频率最高的是白色念珠菌中的伴随UMP-焦磷酸化酶的丧失、或者活性降低而获得的耐受性，已经明确5-FC敏感度与UMP-焦磷酸化酶酶活性相关。据报道在细胞核相为一倍体的Candida glabrata中，有由于胞嘧啶透性酶或CD的缺陷而导致产生的耐受菌株。

另一方面，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是革兰氏阳性厌氧性细菌，其基因组中的GC含量高(例如，参见非专利文献12)。该长双歧杆菌是非病原性的，在人或者其他动物的大肠中构成正常的微生物群体的的大部分(例如非专利文献13)。具有提高免疫反应(例如参见非专利文献14参见)，抑制癌症的发生的效果(例如参见非专利文献15)、保护宿主免受病毒感染(例如，参见非专利文献16、17)、可以产生抗菌物质(例如参见非专利文献18)等，具有促进宿主健康的特性。双歧杆菌种在世界范围内广泛的的发酵乳制品的制备中被使用。