[发明专利]一株枯草芽孢杆菌新菌株及其在制备治疗血栓疾病药物中的用途

权利要求书

1.一种纳豆激酶，其特征在于：所述的纳豆激酶由如下方法制备得到：

a、中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO：M204092的枯草芽孢杆菌DIAO 1502，即Bacillus subtillis Diao 1502，培养后作为发酵用种子液；

b、利用a步骤种子液经液态发酵或固态发酵得到纳豆激酶；

步骤b中所述液态发酵为：种子液按照5%～20%（v/v）的接种量接入发酵培养基中，于30～40℃，转速180～220rpm，振荡培养24～72h，离心，上清液滤膜浓缩，干燥后得到纳豆激酶成品；

步骤b中所述固态发酵为：按重量配比每1000g豆渣喷洒固态发酵营养液20～120ml，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照5%～20%（v/w）的接种量接入培养基中，于30～45℃，湿度≧80%，培养12～56h，干燥后得到纳豆激酶成品；

所述纳豆激酶在SDS-PAGE凝胶上28KD到14.4KD间出现多条条带，其图谱如图3所示。

2.根据权利要求1所述的纳豆激酶，其特征在于：所述纳豆激酶的HPLC图谱如图1所示，由1个特征峰组成，

其中色谱条件为： 

色谱柱：Waters Protein－Pak? 60 7.8×300mm 

流动相：0.2mol/L NaH₂PO₄-CH₃OH，其中NaH₂PO₄：CH₃OH 为95:5

流速：1ml/min

检测波长：220nm

纳豆激酶的绝对保留时间在7～9min之间出峰。

3、一种制备权利要求1~2任意一项所述的纳豆激酶的方法，包括：

a、中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO：M204092的枯草芽孢杆菌DIAO 1502，即Bacillus subtillis Diao 1502，培养后作为发酵用种子液；

b、利用a步骤种子液经液态发酵或固态发酵得到纳豆激酶。

4、根据权利要求3所述的制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述液态发酵为：

种子液按照5%～20%（v/v）的接种量接入发酵培养基中，于30～40℃，转速180～220rpm，振荡培养24～72h，离心，上清液滤膜浓缩，干燥后得到纳豆激酶成品。

5、根据权利要求4所述的制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述液态发酵的发酵培养基为：C源5～35 g/L，N源5～45 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 0.5～3 g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5～4 g/L，CaCl₂ 0.05～1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05～1.5 g/L，pH 7.5±1.0；所述C源为蔗糖、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉或蜜糖，N源为：动物蛋白胨、玉米浆、酵母膏、牛肉膏、植物或豆浆。

6、根据权利要求3所述的制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述固态发酵为：按重量配比每1000g豆渣喷洒固态发酵营养液20～120ml，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照5%～20%（v/w）的接种量接入培养基中，于30～45℃，湿度≧80%，培养12～56h，干燥后得到纳豆激酶成品。

7、根据权利要求6所述的制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述固态发酵的固态发酵营养液组分：甘油50～300 g/L，蛋白胨50～300 g/L，牛肉膏50～100 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 5～20 g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 5～20 g/L，CaCl₂ 0. 5～10 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～10 g/L，pH 7.5±1.0。

8、权利要求1~2任意一项所述的纳豆激酶在制备治疗血栓疾病药物中的用途。

9、一种中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO：M204092的枯草芽孢杆菌DIAO 1502，即Bacillus subtillis Diao 1502。