[发明专利]在昆虫细胞中制备的重组E－选择蛋白

说明书

相关申请

本申请要求2005年3月10提交的美国临时申请60/660,258的优先权。上述申请的全文并入本文参考。

发明背景

E-选择蛋白是一种细胞表面糖蛋白细胞粘附分子，其是细胞因子可诱导的并且只在内皮细胞上发现。E-选择蛋白介导多种白细胞与激活的内皮的粘附，所述白细胞包括中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、天然杀伤细胞(NK)和T细胞亚类。E-选择蛋白在人内皮细胞上的表达是由应答炎症相关细胞因子IL-1和TNFα以及应答脂多糖(LPS)通过转录正调节而被诱导的。

常规的抗炎干预包括耗尽白细胞的循环库(circulatory pool)、抑制白细胞功能、和使用免疫抑制药物如环孢菌素A和FK506。然而，大多数可利用的免疫抑制剂具有全身性副作用，限制了其长期应用。

已经显示出自身抗原的粘膜给药在中风和动脉硬化模型中以及在一些自身免疫性疾病模型如糖尿病、关节炎和实验变态反应性脑脊髓炎模型中可抑制炎症和疾病活性。通过鼻/口腔多次给予低剂量的E-选择蛋白诱导对E-选择蛋白的粘膜耐受性。粘膜耐受性是一个公认的模型，由此通过鼻部滴注或鼻饲抗原而诱导对该特异抗原的免疫学耐受性。经鼻部给予的抗原遭遇到鼻部相关的淋巴组织，其已经进化为保护宿主免于入侵的病原体侵犯并获得了防止宿主与吸入的非病原性蛋白质反应的固有性质。在重复给予低剂量抗原后产生主动耐受性(active tolerance)，伴有调节性T细胞产生。

E选择蛋白表达不是组成型的，基本上限于应答炎症刺激物如IL-I、TNF-α或LPS而变得活化的内皮。E-选择蛋白可以在体内局部炎症部位长期表达，由此E-选择蛋白作为合适的耐受分子指导已经耐受E-选择蛋白的调节性T细胞到达内皮激活的局部部位。这些已经用低剂量方案耐受的调节性T细胞在用抗原再刺激时分泌抑制TH1免疫应答的细胞因子如IL-10和转化生长因子(TGF)b1。尽管这些T细胞的激活特异于耐受抗原(在这种情况中为E-选择蛋白)，但是应答激活而分泌的免疫调节性细胞因子具有非特异性作用。因此，无论所述耐受抗原存在在哪里，局部免疫抑制均将发生。

通过使用E-选择蛋白作为耐受剂，可以将免疫抑制靶向于激活的血管节段(vessel segment)。

发明概述

本发明的特征包括重组的哺乳动物E-选择蛋白肽，编码这些肽的核酸，具有这些核酸的载体和细胞，及生产所述肽的方法。本发明进一步的特征包括使用重组的哺乳动物E-选择蛋白肽诱导对E-选择蛋白的粘膜耐受性而治疗炎症疾病的方法。

本发明提供了一系列哺乳动物E-选择蛋白肽。一种E-选择蛋白肽基本上由野生型人E-选择蛋白(SEQ ID NO：1)的第20-303位残基组成。这种肽可具有附着于其的一或多个C末端标记，包括羧基末端二肽RS。另外，本发明包括附着有N末端分泌信号肽的这种肽。尽管优选人重组肽，但也可以使用其它哺乳动物肽，优选是与SEQ IDNO：1具有至少60％相同性的由200-400个氨基酸组成的肽。本发明也涵盖哺乳动物E-选择蛋白肽的混合物和组合。

本发明的肽的C末端标记包括纯化标记和稳定化标记如c-myc标记和组氨酸标记。N末端分泌信号肽包括哺乳动物和昆虫细胞衍生的肽。N末端分泌性信号肽包括AcMNPV gp64 env分泌序列MGWSWIFLFLLSGTASVHS(SEQ ID NO：3)，信号肽序列MGWSWIFLFLLSGTAS(SEQ ID NO：4)，以及野生型人信号序列肽MIASQFLSALTLVLLIKESGA(SEQ ID NO：2)。本发明的肽可以在多种细胞系中生产，包括昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞和酵母。

本发明的特征还在于编码一系列哺乳动物E-选择蛋白肽的核酸分子。所述核酸分子编码基本上由野生型人E-选择蛋白(SEQ ID NO：1)的第20-303位残基组成的E-选择蛋白肽。编码这种E-选择蛋白肽的核酸分子可具有附着于其的一或多个C末端标记，包括羧基末端二肽RS。另外，本发明包括编码附着有N末端分泌性信号肽的这种基本E-选择蛋白肽的核酸分子。尽管优选编码优选地具有200-400个氨基酸的人重组肽的核酸分子，但是也可以使用编码与SEQ ID NO：1具有至少60％相同性的其它哺乳动物肽的核酸分子。本发明也涵盖哺乳动物E-选择蛋白肽的混合物和组合。