[发明专利]猪痢疾短螺旋体的基因和蛋白质及其用于诊断和治疗的用途

说明书

发明领域

本发明涉及猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)的新基因和其中编码的蛋白质。本发明还涉及这些新基因和蛋白质用于诊断猪痢疾短螺旋体病、抗猪痢疾短螺旋体疫苗，和用于筛选杀死猪痢疾短螺旋体或阻断猪痢疾短螺旋体的病理效应的化合物的用途。这些序列还可以用于诊断性和治疗性和/或预防性地治疗动物内由其他短螺旋物体属物种所致的疾病，其中所述的其他短螺旋体属物种包括密螺旋体(B.intermedia)、B.alvinipulli、阿尔堡短螺旋体(B.aalborgi)、无害短螺旋体(B.innocens)、B.murdochii和多毛短螺旋体(B.pilosicoli)。

发明背景

猪痢疾是在澳大利亚和世界范围内主要的地方流行性猪疾病。猪痢疾是传染性黏膜出血(mucohaemorrhagic diarrhoeal)疾病，其特征是大肠上皮表面的广泛炎症及坏死。因猪痢疾所致的经济损失主要由生长迟缓、药疗法成本和死亡率造成。猪痢疾的病原体在1971年最初鉴定为厌氧螺旋体(随后称作猪痢疾密螺旋体(Treponema hyodysenteriae))并且最近重新划分至短螺旋体属(Brachyspira)为猪痢疾短螺旋体。猪痢疾的疾病谱可以从温和、短暂性或不明显变化至严重或致死。各猪舍内的药疗法策略可能掩盖临床病征并且在一些猪舍内疾病可能被忽略或可能仅为可疑。无论明显的疾病是否发生，猪痢疾短螺旋体可以保持于感染猪内或其他储存宿主如啮齿类动物内或在环境中。所有这些来源为疾病传染至未感染猪群提供潜在可能。

猪痢疾短螺旋体的建群激发强烈的抗螺旋体免疫应答，因此暴露于螺旋体的间接证据可以通过测量感染动物血内的循环抗体滴度而获得。已经报道这些抗体滴度维持于低水平，即便在已从猪痢疾中恢复的动物内也是如此。因此认为检测抗体的血清学试验具有检测亚临床感染和在其大肠内具有不可检测数目的螺旋体的恢复猪携带者的巨大潜力。这些试验作为易用试剂盒形式如酶联免疫吸附测定时将特别有价值。已经开发多种技术以证实存在抗猪痢疾短螺旋体的循环抗体，这些技术包括间接免疫荧光抗体试验、血凝试验、微量滴定凝集试验、补体激活试验和使用脂多糖或经超声波破碎的完整螺旋体作为抗原的ELISA。所有这些试验都遭受特异性问题的困扰，因为相关的非致病性肠道螺旋体可以诱导交叉反应抗体。这些试验可用于检测其中存在明显疾病和高循环抗体滴度的畜群，但是这些试验在鉴定亚临床感染畜群和感染猪个体上存在问题。因此，迄今没有用于检测抗猪痢疾短螺旋体抗体的非常灵敏而特异的测定法。合适诊断试验的缺乏已经妨碍猪痢疾的控制。

使用多种方法以控制猪痢疾，这些方法包括预防性使用抗微生物剂以完全转移感染畜群并防止感染携带猪的再进入。所有这些选项代价高昂，并且如果它们充分有效，则需要使用复杂的诊断试验以监测进度。目前，对亚临床感染猪痢疾的畜群和单个健康携带动物的检测仍是主要难题并且正在妨碍执行有效的控制措施。确定性诊断猪痢疾通常需要分离并鉴定来自病猪粪便或黏膜的猪痢疾短螺旋体。所涉及的主要困难包括这些厌氧细菌生长缓慢及其营苛刻的营养要求，以及因猪肠道正常菌群内存在形态学相似的螺旋体所致的混淆。显著改进感染猪个体的诊断通过开发检测来自粪便的螺旋体的聚合酶链式反应(PCR)测定而实现。不幸的是在实际应用中，PCR检测的限制使它们不能够检测到具有亚临床感染的携带动物。由于这些诊断难题，显然需要能够在猪群和个体水平检测猪痢疾短螺旋体感染的简单而高效的诊断工具。

强烈的抗螺旋体免疫应答在猪痢疾短螺旋体建群后被诱导，并且从猪痢疾中恢复的猪受到保护而不发生再感染。尽管如此，开发疫苗以控制猪痢疾的尝试仅获得非常有限的成功，因为这些疫苗不提供基于畜群的充分保护，或生产它们过于昂贵且困难以至于它们没有商业实用性。菌苗疫苗提供某些水平的保护，但是菌苗疫苗总是脂多糖血清群特异性的，因此需要使用多价菌苗。此外，菌苗疫苗因螺旋体苛刻的厌氧生长条件而在大规模生产时困难且昂贵。

已经数度尝试开发用于猪痢疾的减毒活疫苗。这种方法具有如此缺点，即减毒株表现建群减少并因此导致免疫刺激减少。生产者和兽医人员因为存在毒力回复可能而不愿意使用猪痢疾活疫苗，尤其当对猪痢疾短螺旋体内的遗传调节及组成知之甚少时。