[发明专利]组织或细胞固定剂与一种或多种光活性醌族化合物，尤其是金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素，的组合

说明书

技术领域

本发明涉及组织或细胞固定剂和一种或多种光活性醌族化合物的溶液组合或试剂盒组合。

本发明还涉及一种细胞或组织的标记方法，该方法使用一种或多种光活性醌族化合物，其中，所述细胞或组织与组织或细胞固定剂接触的同时或随后被所述光活性醌族化合物标记。

背景技术

光活性醌族化合物尤其包括多环醌，例如金丝桃素(hypericin)、竹红菌甲素(hypocrellin A)、竹红菌乙素(hypocrellin B)或它们的衍生物。

“衍生物”是指化学修饰的化合物，其中，修饰被认为是化学领域的技术人员的常规手段，如酸的酯化或酰胺化；引入保护基团，如对醇或硫醇引入苄基，对胺引入叔丁氧基羰基。

竹红菌甲素(1H-环庚[ghi]苝-5，11-二酮，1-乙酰基-2，3-二氢-2，6，12-三羟基-4，8，9，13-四甲氧基-2-甲基-，顺式)和竹红菌乙素(1H-环庚[ghi]苝-5，12-二酮，3-乙酰基-6，11-二羟基-4，8，9，13-四甲氧基-2-甲基)是从真菌竹小肉座菌(Hypocrella bambusae)和竹黄菌(Shiraia bambusicola)分离的醌。

竹红菌甲素                                               竹红菌乙素

这些色素与光线疗法结合使用以治疗各种皮肤疾病。最近，已确定它们的抗病毒的特性，并发现在光动力治疗癌症中，这些醌是很强的光敏剂(Hirayama等，1997；Zhang等，1998)。

在甲醇中检测荧光最大吸收波长和最大发射波长，竹红菌甲素的分别是463nm和600nm，竹红菌乙素的分别是459nm和616nm。

金丝桃素的化学式是1，3，4，6，8，13-六羟基-10，11-二甲基菲并(1，10，9，8，opqra)苝-7，14-二酮：

金丝桃素是从金丝桃属(Hypericum genus)植物中分离出的天然色素，它是很强的蛋白激酶C的选择性抑制剂。

金丝桃素具有广泛的药物特性，它具有抗菌或抗病毒活性，抗肿瘤活性和诱导凋亡。金丝桃素的光敏性很早就为人所知，并被用作抗抑郁药(金丝桃属植物)组合物的一部分。

金丝桃素是荧光分子，在乙醇中测定的最大吸收波长和最大发射波长分别为591nm和594nm。

已表明灌注在膀胱中的金丝桃素选择性地积聚在膀胱上皮癌细胞中。这个特性与其光敏性和荧光特性相关，并使许多研究组提出了采用体外(ex vivo)荧光细胞诊断癌症(Olivo等，2003a；Olivo等，2003b；Pytel和Schmeller，2002)。还提出了使用金丝桃素对膀胱癌损伤进行光动力治疗(Kamuhabwa等，2004)。这些方法涉及在患者的膀胱中体内注入金丝桃素。

众所周知金丝桃素是能结合到细胞膜脂双层中的亲脂分子。该结合的精确机制还不清楚，但是推测该结合涉及主动运输。因此，到目前为止，金丝桃素仅用于活细胞中。

到目前为止，人们认为必需在活细胞中才能用金丝桃素进行标记，例如，在含金丝桃素的溶液中对细胞进行体外培养或者将金丝桃素与分离不久的细胞或组织临时接触，以便金丝桃素能被活细胞结合。

发明内容

与所有的预料相反的是，本发明人发现与固定剂混合的金丝桃素能被悬浮在固定剂和金丝桃素的混合液中的肿瘤细胞非常迅速地结合，即使这些细胞通过与固定剂接触而被杀死。金丝桃素被活细胞或死细胞同等有效地固定的证据为使用金丝桃素和更普遍地使用光活性醌族化合物进行细胞或组织标记提供了新的可能性。

固定是意在杀死细胞以便最大可能地按照它们被发现时的活着的状态保存的操作。如果不进行固定，则存在自溶的风险。最好的固定剂是那些作用迅速且产生的次级修饰或作用最小的固定剂，所述的次级修饰或作用可能造成细胞内部形态的非常不真实的迹象。

因此，通过在用细胞或组织固定剂固定细胞的同时或之后采用一种或多种光活性醌族化合物尤其是金丝桃素进行标记，可以在任何时候对细胞或组织进行研究，而不必将细胞保持在活的状态。

此外还表明，当将肿瘤细胞悬浮在含微摩尔的金丝桃素的固定剂溶液中时，金丝桃素对细胞的亲和力使几乎所有的金丝桃素都被细胞结合。由于细胞悬浮液的液相实际上不再含金丝桃素，因此可以不洗涤细胞悬浮液而直接分析细胞(形态和/或荧光发射分析)。因此，这种特性使细胞/组织的制备和细胞的分析可以自动化。