[发明专利]用于纯化抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽纯化领域。本文描述了使用离子交换树脂纯化免疫球蛋白的新方法。本文同时提供了快速确定纯化条件的方法。

背景技术

蛋白质，尤其是免疫球蛋白在当今的医学领域中起着重要作用。对于人的应用，每一种药物必须满足独特的标准。为确保生物药剂对人的安全性，尤其要除去可导致严重伤害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质。为满足质量管理规格标准，必须在生产过程之后进行一个或多个纯化步骤。其中，纯度、生产量和产率在确定合适的纯化方法中起着重要作用。

已良好地建立不同的方法并且已将其广泛地用于蛋白质的纯化，例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如，阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式的交换)、亲硫吸附(例如使用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水性相互作用或芳香族化合物吸附层析(例如使用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和层析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻层析和电泳方法(例如凝胶电脉、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

Necina，R.等人，Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698，报导了通过表现为高电荷密度的离子交换介质从细胞培养物上清液直接捕获人单克隆抗体。在WO 89/05157中，报导了通过直接对细胞培养基进行阳离子交换处理纯化产物免疫球蛋白的方法。Danielsson，A.等人，J.Immun.Meth.115(1988)，79-88描述了从小鼠腹水一步纯化单克隆IgG抗体的方法。

Raweerith，R.等人(J.Immun.Meth.282(2003)63-72)使用方法的组合，即，辛酸沉淀法(caprylic acid precipitation)和离子交换层析的组合作为分级分离胃蛋白酶消化的马抗蛇毒素F(ab′)₂抗体的方法。在WO2003/102132中报导了用于纯化蛋白质的非亲和纯化步骤和高效切向流过滤的组合。在WO 92/19973中报导了两种亲和层析步骤的组合。

Follman，D.K.和Fahrner，R.L.报导了使用无A蛋白的三个层析步骤的抗体纯化方法的析因筛选(factorial screening)(J.Chrom.A 1024(2004)79-85)。Mhatre，R.等人(J.Chrom.A 707(1995)225-231)探究了使用阳离子交换层析和pH梯度洗脱对抗体Fab片段进行纯化。

WO 94/00561报导了人单克隆抗猕猴抗体和产生该抗体的细胞系。在WO 2004/024866中报导了通过离子交换层析纯化多肽的方法，在所述方法中，使用梯度洗涤从一种或多种污染物中分离出目的多肽。Schwarz，A.等人(Laborpraxis 21(1997)62-66)报导了使用CM-HyperD-柱对单克隆抗体的纯化。

WO 2004/076485报导了使用A蛋白和离子交换层析进行抗体纯化的方法。在EP 0 530 447中报导了通过组合三个层析步骤纯化IgG单克隆抗体的方法。在US 4,983,722中报导了从抗体制品中除去A蛋白。

WO 95/16037报导了通过A蛋白阳离子交换层析进行的从杂种杂交瘤纯化抗EGF-R/抗-CD3双特异性单克隆抗体。在EP 1 084 136中报导了通过使用离子交换层析从抗体多聚体分离其单体。US 5,429,746涉及使用疏水作用层析组合层析纯化抗体分子蛋白质。

发明概述

因此本发明的目的是提供用于纯化重组产生的免疫球蛋白和用于分离单体和多聚体免疫球蛋白种类的另一种方法。

本发明提供了用于纯化免疫球蛋白的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a)提供包含免疫球蛋白、缓冲物质和任选的盐的溶液；

b)在免疫球蛋白借以与弱离子交换材料结合的条件下，使溶液和该弱离子交换材料接触；

c)通过使用包含缓冲物质和盐的溶液，以单步骤从弱离子交换材料回收免疫球蛋白。

本发明还提供了用于确定在单步骤纯化方法中从离子交换层析材料洗脱多肽的盐浓度的方法，其包括下列两个步骤：

a)步骤1包括下列亚步骤：

a1)提供包含多肽、缓冲物质和任选的盐的溶液；