[发明专利]涉及平行和同时分离的电泳方法

说明书

技术领域

本发明涉及牵涉平行和同时分离的电泳方法。

背景技术

由于在DE805399；Barrolier，J等人在Z.Naturforschung，1958，13B，第754-755页；Hannig，K.在Zeitschrift der AnalytischenChemie，1961，181，第244-254页和Roman，M.等人在Journal ofChromatography 1992，592，第3-12页中公开了被称为自由流动电泳(FFE)的方法的原理，因此发现在工业和化学中使用的有效分析和制备方法当中这一技术具有永久的位置。尽管小的离子以及大的颗粒二者均可使用这一技术分离，但主要应用是分级蛋白质，特别是生物技术生产酶和其他生物活性蛋白质、膜颗粒和甚至存活细胞。与能分离单独的样品组分的其他方法相比，FFE提供两个主要的优点：(i)可连续进行分离且能使人获得多达数百mg或者甚至g含量的纯物质/小时，和(ii)分离过程温和且保持被分离组分的酶活性。FFE技术尤其可用于分离和分级复杂蛋白质，因此可应用于proteomics的应急领域，该领域在科学研究、药物、生物技术和临床诊断市场中变得愈加重要。例如，当proteomic研究增长时，愈加需求改进蛋白质的分离性能，特别是相对于离析工艺的可靠度和通用的前端。

一般地，自由流动的分离方法适合于分离任何分子量的离子以及生物颗粒。通常不关心待分离的样品是否本身荷电或者是否通过吸收或吸附离子产生电荷。在例如美国专利5275706中反映了通过稳定介质和逆流介质，连续偏转电泳的方法及其改进，其公开内容在此通过参考引入。根据这一专利，逆流介质与分离介质流动方向相反地引入到分离空间内。这两种介质通过分级出口排放，从而导致具有低空隙体积的分级，和另外维持介质在例如具有非常低湍流的分级出口区域内的层流。可在例如美国专利申请2004/0050697中找到各种模式的自由流动电泳的讨论，其公开内容在此通过参考引入。

等电点聚焦是一种电泳技术，它给缓冲溶液增加pH梯度，且与电场一起集中大多数两性的生物材料。两性生物材料，例如蛋白质、肽和病毒在酸性介质内荷正电和在碱性介质内荷负电。在IEF期间，在横向，即与流动方向相反的方向上建立的pH梯度内这些材料迁移到其等电点(pl)，在此它们不具有净电荷并形成稳定的窄区域。在这一点处，材料终止横向迁移且它们变得集中。在这一技术中，不存在电压的依赖关系。等电点聚焦得到这种高离析带，这是因为通过pH梯度和电场的结合作用，由于扩散或流体运动导致的从其等电点处移开的任何两性生物材料将会返回。聚焦工艺因此纯化并浓缩样品为相对稳定的带。这是得到一些最高离析分离的强有力概念，特别是当在二维凝胶内与电泳结合时。

区域电泳是可在FFE中使用的另一种分离模式。区域电泳主要基于电荷，且在较小的程度上基于形式与尺寸来分离生物颗粒。可在FFE中使用的进一步的模式是等速电泳(ITP)。ITP FFE涉及使用非均质的分离介质。当各组分与起始样品的主要带分离时，基于局部的条件，这些组分与本体样品流动相反地进入当它们加速或减速时的区域内。然后利用这一所谓的聚焦效果从本体样品中分级所得的组分。

典型地，FFE方法涉及通过使样品流经在腔室内的单一分离空间进行分离，其中这一空间被两个电极从侧面包围(flank)。在美国专利申请US 2004/045826中反映了在单一的腔室内允许平行和同时聚焦的改进方法。这一专利申请公开了具有多个电极的单一分离腔室，以便在单一腔室内提供多个分离空间。希望在单一腔室内涉及平行、同时分离的进一步改进。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供一种方法，该方法包括下述步骤：

(a)提供含第一端壁、第二端壁、第一侧壁、第二侧壁和两块板的分离腔室，其中端壁、侧壁和板确定分离空间；位于分离腔室内分别与第一侧壁和第二侧壁邻近的单一阳极和单一阴极；与第一端壁相邻地布置的至少两个样品入口；与第一端壁相邻地布置的至少两个分离介质入口；与第一端壁相邻且与阳极相邻的第一阳极稳定介质入口；与第一端壁相邻且与阴极相邻的第一阴极稳定介质入口；和一个或更多个额外的阳极稳定介质入口和一个或更多个额外的阴极稳定介质入口，其中额外的阳极和阴极稳定介质入口与第一端壁相邻地布置且进一步位于第一阳极稳定介质入口和第一阴极稳定介质入口之间，

(b)通过至少两个分离介质入口引入至少一种分离介质到分离腔室内，

(c)通过至少两个样品入口引入一种或更多种待分离的样品到分离腔室内，和