[发明专利]尿酸氧化酶的变体形式及其用途

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年4月11日提交的美国临时申请系列号60/670,541的优先权和权益，该临时申请的公开内容通过引用结合到本文中。

发明领域

本发明涉及遗传修饰的具有尿酸分解活性的蛋白质。更具体的说，本发明涉及包含截短的尿酸氧化酶的蛋白质及其生产方法。

发明背景

术语尿酸氧化酶(urate oxidase)和尿酸酶(uricase)在本文中可互换使用。尿酸氧化酶(尿酸酶；E.C.1.7.3.3)这种酶能催化尿酸氧化成更具可溶性的产物尿囊素，尿囊素是更容易排泄的嘌呤代谢物。人不产生有酶活性的尿酸酶，这是因为在高等灵长类的进化过程中获得的尿酸酶基因的几个突变所致。Wu，X等，(1992)J Mol Evol 34：78-84，该文献通过引用整体结合到本文中。因此，在易感个体中，血液中过量浓度的尿酸(高尿酸血症)会导致疼痛性关节炎(痛风)、毁形性尿酸沉积(结节瘤)和肾衰竭。在一些受侵害个体中，可用的药物如别嘌醇(尿酸合成的抑制剂)会产生治疗限制性副作用，或者不能充分减轻这些病症。Hande，KR等，(1984)Am J Med76：47-56；Fam，AG，(1990)Bailliere’s Clin Rheumatol 4：177-192，每个文献通过引用整体结合到本文中。尿酸酶注射能减少高尿酸血症和高尿酸尿症，至少是短暂地减少。由于尿酸酶在人体中是异种蛋白，在某些百分比的受治疗患者中，即使是第一次注射来自黄曲霉(Aspergillus flavus)的未修饰蛋白质就会引起过敏反应(Pui，C-H等，(1997)Leukemia 11：1813-1816，该文献通过引用整体结合到本文中)，免疫应答限制其用于长期或间歇治疗的效用。Donadio，D等，(1981)Nouv Presse Med 10：711-712；Leaustic，M等，(1983)Rev Rhum Mal Osteoartic 50：553-554，每个文献通过引用整体结合到本文中。

本发明涉及发生截短和结构稳定性增强的突变重组尿酸酶蛋白。

发明概述

本发明的目的是提供新型的重组尿酸酶蛋白。所设想的本发明蛋白质相对于天然尿酸酶蛋白是截短的，且具有突变的氨基酸。

本发明提供包含SEQ ID NO.8氨基酸序列的突变重组尿酸酶。还提供包含SEQ ID NO.13氨基酸序列的突变重组尿酸酶。

本发明的另一个目的是提供代谢尿酸的方法，所述方法包括给予具有尿酸分解活性的新型重组尿酸酶蛋白。尿酸分解活性在本文中用以指尿酸向尿囊素的酶促转化。

在一个实施方案中，尿酸酶包含SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.12的8位至287位的氨基酸序列。本发明还提供了包含SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.13的氨基酸序列的尿酸酶。在一个实施方案中，尿酸酶包含氨基末端氨基酸，其中氨基末端氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。在一个特别实施方案中，氨基末端氨基酸是甲硫氨酸。

本发明还提供分离的核酸，其包含编码本发明尿酸酶的核酸序列。在一个具体实施方案中，编码尿酸酶的核酸有效连接到异源启动子，例如osmB启动子。本发明还提供包含尿酸酶编码核酸的核酸载体和包含这种载体的宿主细胞，以及产生尿酸酶的方法，所述方法包括在所述核酸序列得以被宿主细胞表达的条件下培养宿主细胞以及分离表达的尿酸酶的步骤。

附图简述

图1说明质粒pOUR-P-ΔN-ks-1的结构。限制位点旁的数字表示核苷酸位置，该位置相对于指定为1的HaeII位点而言。在克隆过程中丢失的限制位点在括号中标出。

图2显示猪-KS-ΔN尿酸酶的DNA和推导氨基酸序列(分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.7)。图2中的氨基酸编号是相对于完全猪尿酸酶序列进行的。在起始密码子甲硫氨酸残基之后，苏氨酸置换猪尿酸酶序列中的天冬氨酸7。指出了用于亚克隆的各个步骤的限制位点。3′非翻译序列用小写字母显示。翻译终止密码子由星号表示。

图3显示各种重组猪(SEQ ID NO.11)、PBC-ΔNC(SEQ ID NO.12)和猪-KS-ΔN(SEQ ID NO.7)尿酸酶序列的推导氨基酸序列的相对比对。星号表示与公开的猪尿酸酶序列相比猪-KS-ΔN中氨基酸有差异的位置；圆圈表示与PBC-ΔN相比猪-KS-ΔN中氨基酸有差异的位置。虚线表示氨基酸的缺失。