[发明专利]用于单个微生物的快速检测和鉴定而无需初步培养的装置

说明书

                      发明背景

1.发明领域

现代微生物诊断学和分析用于存在于不同样本中的微生物的检测、计数和鉴定。在医学诊断学和兽医学领域内，这些生物是人或动物血液、内脏器官、皮肤、组织、呼吸器官等中的致病微生物或危险微生物。在工业微生物学领域，微生物通常污染技术方法、材料、设备和成品。在环境分析中，通常存在水、室内和室外空气以及各种表面的微生物污染。在流行病学和生物防御中-来自人体或环境的传染性致病微生物。

微生物学分析的时间、质量和灵敏度因两个原因是至关重要的。首先，成千上万的国内微生物实验室每年花费数十亿美元用于工业中的产品和流程质量控制以及污染和腐败的预防。这些实验室也花费钱以提供用于人、动物、植物、食品、个人护理用品、土壤和环境的诊断检测。快速、可靠、流水线诊断检测长期可节约公司数百万美元。第二，既使在象美国一样高度发达的国家中数千人也由于长时间的诊断造成的医疗延迟而死亡。通过减少进行这些微生物诊断检测所花费的时间将导致分析可靠性和灵敏度的增加。最终，这可在世界范围内挽救数千人的生命。

本发明是用于微生物的快速检测和鉴定而无需初步培养的装置。

2.相关领域的描述

可将用于微生物的检测、计数和鉴定的现代方法分成两大部分：1)需要初步培养(富集)以产生可检测量的细胞的方法和装置；2)因为其能够分析少至单个细胞从而不需要初步培养的方法。

第一组包括在固体或液体常规或选择营养培养基中的培养。其也包括几种免疫学方法。实例是乳汁和红细胞凝集、磁颗粒上的抗体、酶联免疫测定法如ELISA和Western印迹法、和“deepstick”法。第一组也包括脂肪酸的层析法、红外拉曼和FTIR光谱学、质谱法和ATP-、生物-和化学发光法。这些方法需要数百至数百万纯细胞来进行某些微生物的检测，从而需要长时间(许多小时或天)的初步培养。

第二组方法和装置不需要初步培养，因为它们能够检测和/或鉴定甚至单个细胞。这些方法和装置由成组的核酸方法如PCR和其不同的修饰、外荧光(Epi-fluorescent)法(荧光底物法(fluorogenicsubstrate method)、免疫荧光法)和成组的流式细胞计量术组成。

除了其他缺点外，无需初步培养的细胞检测和/或鉴定方法通常需要非常昂贵和复杂的设备以及高水平专业工作。例如，用于PCR的装置包括昂贵的热循环仪和复杂的荧光计。PCR也只用于鉴定目的。使用PCR进行最初污染的计数是不可靠的。PCR对于可污染检测本身的生物是非常敏感的。

外荧光通常只需要荧光显微镜来检测用荧光染料或荧光抗体(Ab+荧光染料)标记的单个细胞。然而，存在的荧光物质的量受到细胞体积或细胞表面的限制。小体积的目标(单个微生物)使单个细胞的检测非常困难，特别是大量背景荧光通常存在于大部分样本中。对于外荧光方法，流出细胞的物质或单个细胞的酶免疫测定是不可能的，因为这些指示剂物质立即分散在周围空间而不是集中在小体积内，如由本发明提及的小体积内。

流式细胞计量术(Flow Cytometry)基于非常复杂的光电子学系统。流式细胞仪由复杂的聚光装置、电子元件、复杂的水动力系统和高速计算机组成。不同类型的流式细胞仪的价格在$50,000至$140,000的范围内。流式细胞仪可在一个单个细胞流过各自具有10微米直径的通道过程中对其进行分析。通道的尺寸是如此狭窄以至于其需要17个小时才能使100ml液体通过，即使流速为每秒20米。因此，流式细胞仪目前用于血液学，因为血液细胞的量大(5-6百万个/ml)和或多或少稳定的浓度。同样，流式细胞仪在细胞学中作为细胞混合物的分选器是非常有效的。流式细胞计量术在微生物学中的使用不容易。在微生物学中通常不使用这些仪器，因为微生物可与其他颗粒产生群集体并且可与天然颗粒或死细胞混杂在一起。如果样本中细胞的浓度非常低，分析的时间急剧增加。因此，对于流式细胞计量术的微生物学应用，需要初始浓聚或甚至富集。微生物在尺寸和形状上的变化也比血细胞丰富得多，因此，经常发生错误。