[发明专利]用于制备经稳定转化的、能育的玉米植物的改良方法

权利要求书

1.用于制备转基因玉米植物的方法，其包括步骤：

a.分离玉米植物的不成熟胚，和

b.用共培养培养基将所述分离的不成熟胚与包含至少一个转基因T-DNA且属于根瘤菌科属的细菌共培养，所述不成熟胚未进行去分化处理，所述T-DNA包含至少一个选择性标记基因，和

c.将所述共培养的不成熟胚转移至恢复培养基，所述恢复培养基包含：

i.有效量的至少一种抗生素，其抑制或阻抑土传细菌生长，和

ii.浓度从约1g/l到约10g/l的L-脯氨酸，和

iii.浓度从约1μM到约50μM的硝酸银，

iv.有效量的至少一种生长素化合物，

但是不含有效量的毒害植物的选择剂，和

d.诱导胚性愈伤组织形成，并在培养基上选择转基因愈伤组织，所述培养基包含：

i.有效量的至少一种生长素化合物，和

ii.有效量的选择剂，所述选择剂允许选择包含转基因细胞，和

e.从所述转基因愈伤组织再生并选择植物，所述植物含有转基因T-DNA。

2.权利要求1的方法，其中所述不成熟的胚来自近交、杂种、近交之间的F1、近交和杂种之间的F1、近交和自然传粉变种之间的F1、市售F1变种、前述变种和前述任何后代之间杂交或自花传粉的任何F2。

3.权利要求2的方法，其中不成熟胚分离自(HiIIA×A188)杂种与近交系的杂交，所述近交系选自代表性种子已以专利保藏号PTA-6170和PTA-6171保藏于美国典型培养物保藏中心的近交系。

4.权利要求1到3中任一项的方法，其中所述不成熟胚是处于传粉后不少于2天的阶段中的胚。

5.权利要求1到4中任一项的方法，其中分离所述不成熟胚，并用农杆菌悬液直接接种，不经额外的预先洗涤步骤。

6.权利要求1到5中任一项的方法，其中分离所述不成熟胚、盾片侧向上置于固体共培养培养基表面并用一滴农杆菌细胞悬液接种。

7.权利要求1到4中任一项的方法，其中不成熟胚被置于琼脂共培养培养基表面的一层或多层滤纸上，或无琼脂培养基的平板中含液体共培养培养基溶液的一层或多层滤纸上。

8.权利要求5或6的方法，其中对共培养步骤而言，将大约一种农杆菌在感染培养基中的悬液直接用于每个胚，并在农杆菌接种后除去多余量的液体。

9.权利要求1到8中任一项的方法，其中有效量的生长素化合物为约0.5mg/l到约6mg/l浓度的2，4-D。

10.根据权利要求1到9中任一项的方法，其中对所述不成熟胚进行转化而不经去分化的预处理，在所述预处理中所述不成熟胚任选用酶处理或被损伤。

11.权利要求1到10中任一项的方法，其中土传细菌为卸甲根癌农杆菌或毛根农杆菌菌株。

12.权利要求1到11中任一项的方法，其中所述用于转化的属于农杆菌属的细菌具有10⁶到10¹¹CFU/ml的细胞群体。

13.权利要求1到12中任一项的方法，其中在共培养中使用的培养基包含约1μM到约10μM的硝酸银，和约50mg/L到约1,000mg/L的L-半胱氨酸。

14.权利要求1到13中任一项的方法，其中选择在单一选择步骤中完成，不经中间组织转移。

15.权利要求1到14中任一项的方法，其中来自再生步骤的生根小植株被直接转移进土壤培养基中。

16.通过将(HiIIA×A188)杂种与选自以下的近交系杂交获得的玉米植物，所述近交系的代表性种子已以专利保藏号PTA-6170和PTA-6171保藏于美国典型培养物保藏中心。

17.权利要求16的玉米植物，其包含转基因T-DNA。

18.转基因玉米植物，其通过用异源基因构建体转化玉米植物、来自下述植物的细胞或组织产生，所述植物选自代表性种子已以专利保藏号PTA-6170和PTA-6171保藏于美国典型培养物保藏中心的植物。

19.权利要求16到18中任一项的玉米植物的后代植物。