[发明专利]携带与L－肉碱生物合成相关基因的肠杆菌科属微生物和使用该微生物生产L－肉碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及包括来源于粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的L-肉碱生物合成相关基因的肠杆菌科(Enterobacteriacae)的微生物，和使用所述微生物生产L-肉碱的方法。

背景技术

L-肉碱(3-羟基-4-三甲基氨基丁酸)在生物体中普遍存在，并且是在线粒体中将活化的长链脂肪酸经由线粒体内膜携带到线粒体基质中的两性离子化合物。已知在人体中L-肉碱可以从赖氨酸或蛋白质赖氨酸合成。在哺乳动物中，蛋白质赖氨酸通常用作L-肉碱生物合成的前体，然而，在粗糙脉孢菌中，应用游离的赖氨酸。在L-肉碱的生物合成中，形成ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N，N，N-三甲基-β-羟基赖氨酸，N，N，N-三甲基氨基丁醛中间体，和γ-丁酰甜菜碱，并且γ-丁酰甜菜碱通过γ-丁酰甜菜碱羟化酶羟基化而成为L-肉碱。图1是图解粗糙脉孢菌中假定的L-肉碱生物合成途径的流程图。

L-肉碱可以通过化学合成法、应用酶反应的半合成法、和应用微生物的方法生产。然而，当应用化学合成法时，存在问题，即获得DL-肉碱外消旋混合物，由此必须分离DL-外消旋混合物。作为应用酶反应的半合成法的一个实例，美国专利号4,221,869公开了使用应用NAD作为辅酶的肉碱脱氢酶(EC 1.1.1.108)，由脱氢肉碱生产L-肉碱的方法。然而，脱氢肉碱极其不稳定并自发分解为丙酮基三甲铵和二氧化碳。另外，德国专利号DE-OS-3123975公开了由γ-丁酰甜菜碱生产L-肉碱的方法，该方法使用从粗糙脉孢菌分离的γ-丁酰甜菜碱羟化酶(EC 1.14.11.1)。然而，存在一个缺点，即在羟基化期间必须将α-酮戊二酸和还原物(即，抗坏血酸)加入反应物中。

关于应用微生物生产L-肉碱的方法，例如，美国专利号5,028,538公开了一种从将大肠杆菌(E.coli)044 K 74培养在含有巴豆酸甜菜碱(4-N，N，N-三乙基氨基巴豆酸)的培养基之后获得的培养物而收集L-肉碱的方法。另外，美国专利号4,708,936公开了通过将木糖氧化产碱菌(Achromobacter xylosoxydans)DSM 3225(HK 1331b)培养在含有巴豆酸甜菜碱和/或γ-丁酰甜菜碱的培养基中来生产L-肉碱的方法。然而，存在缺点，即，应该使用L-肉碱生物合成的前体，诸如巴豆酸甜菜碱，或不是中间体的化合物，并且L-肉碱的产率不高。因此，在应用微生物生产L-肉碱的方法中仍然存在提高产率的需要。

本发明的发明人已经尝试生产应用廉价前体并且还具有高产率的L-肉碱的微生物，并且发现来源于粗糙脉孢菌与L-肉碱的生物合成相关的基因在肠杆菌科的微生物中充分表达，由此完成本发明。

附图描述

图1是图解粗糙脉孢菌中假定的L-肉碱生物合成途径的流程图。

图2是显示洗脱溶液的天然或SDS-PAGE分析的结果的图，所述洗脱溶液通过裂解粗糙脉孢菌培养物并且对裂解的物质进行DEAE柱层析而获得。

图3是显示在将图2的蛋白条带a、b和c与赖氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反应后通过HPLC检测三甲基赖氨酸的结果的图表。

图4是显示通过HPLC分析通过将条带a蛋白反应而获得的样品、以及三甲基赖氨酸标准物的结果的图表。

图5是显示通过PCR扩增LMT基因的电泳结果的图。

图6图示pT7-7 LMT的产生过程。

图7是显示裂解的细菌的上清液SDS-PAGE分析结果的图，所述裂解的细菌通过在IPTG存在下培养含有来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶的大肠杆菌并且将从中获得的细菌裂解而获得。

图8图示pT7-7 TMLH的产生过程。

图9图示pT7-7 TMLA的产生过程。

图10图示pT7-7TMABADH的产生过程。

图11图示pT7-7 BBH的产生过程。

图12是显示分别插入到pT7-7 TMLH、pT7-7 TMLA、pT7-7TMABADH和pT7-7 BBH中的每一基因的电泳结果的照片。在图12中，泳道1代表标记，泳道2代表pT7-7 TMLH，泳道3代表pT7-7 TMLA，泳道4代表pT7-7TMABADH，并且泳道5代表pT7-7 BBH。