[发明专利]来自粗糙脉孢菌的S－腺苷甲硫氨酸－6－N－赖氨酸－甲基转移酶，编码其的基因，包含其的载体和宿主细胞，以及使用该宿主细胞生产三甲基赖氨酸的方法

说明书

背景技术

本发明涉及从粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)获得的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶(LMT)，编码其的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，以及通过培养所述宿主细胞而生产三甲基赖氨酸的方法。

L-肉碱(3-羟基-4-三甲基氨基丁酸)，在生物体中普遍存在，并且是在线粒体中将活化的长链脂肪酸经由线粒体内膜携带到线粒体基质中的两性离子化合物。已知在人体中L-肉碱可以从赖氨酸或蛋白质赖氨酸合成。在哺乳动物中，蛋白质赖氨酸通常用作L-肉碱生物合成的前体，然而，在粗糙脉孢菌中，使用游离赖氨酸。在L-肉碱的生物合成中，形成ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N，N，N-三甲基-β-羟基赖氨酸，N，N，N-三甲基氨基丁醛中间体，和γ-丁酰甜菜碱，并且推测γ-丁酰甜菜碱通过γ-丁酰甜菜碱羟化酶羟基化而成为L-肉碱。

甚至在现有技术中，当在粗糙脉孢菌从游离的赖氨酸生物合成L-肉碱时，参与将ε-N，N，N-三甲基赖氨酸转化成L-赖氨酸的第一步反应的酶还是未知的。所述酶可以有效用来从游离的赖氨酸生产L-肉碱。

本发明的发明人已经尝试产生应用廉价前体并且还具有高L-肉碱生产效率的微生物，并且发现具有将来自粗糙脉孢菌的L-赖氨酸转化成6-N-三甲基赖氨酸的活性的蛋白和基因，因此完成本发明。

附图描述

图1是显示洗脱溶液的天然-PAGE或SDS-PAGE分析的结果的图，所述洗脱溶液通过裂解粗糙脉孢菌培养物并且对裂解物进行DEAE柱层析而获得。

图2是显示在蛋白条带a、b和c与赖氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反应后通过HPLC测量三甲基赖氨酸的结果的图表。

图3是显示通过HPLC分析通过将条带a蛋白与赖氨酸反应而获得的样品、条带a与三甲基赖氨酸标准物的结果的图表。

图4是显示使用琼脂糖电泳方法分析S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因的PCR产物的结果的图。

图5是显示pT7-7 LMT构建的图。

图6是显示上清液SDS-PAGE分析结果的图，所述上清液通过在存在IPTG时培养含有获得于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因的大肠杆菌(E.coli)并且将从中获得的真菌菌体裂解而获得。

发明详述

技术问题

本发明提供一种具有将来自粗糙脉孢菌的L-赖氨酸转化成6-N-三甲基赖氨酸的活性的蛋白和编码其的基因。

本发明还提供包含所述基因的载体和宿主细胞。

本发明还提供通过培养所述宿主细胞而生产三甲基赖氨酸的方法。

技术方案

按照本发明的一个方面，提供一种具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列和S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶活性的蛋白。

按照本发明的蛋白来自于粗糙脉孢菌，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且具有S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶活性。在本发明中，“S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶活性”意欲指使用L-赖氨酸作为底物催化从L-赖氨酸形成三甲基赖氨酸的反应的活性。

按照本发明的另一个方面，提供编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸的一个实例是具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸。

按照本发明的另一个方面，提供包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸的载体。在本发明中，“载体”表示可以作用为能够递送多核苷酸的运载工具(vehicle)的核酸构建体。所述载体，例如，衍生于质粒的载体及衍生于病毒的载体，包括在生物体中不但可以复制还可以不复制的核酸构建体。因此，术语“质粒”、“载体”及“盒”在本发明中互换地使用。另外，所述载体可以包括调节基因表达的调控序列，诸如启动子、操纵子、mRNA核糖体结合位点和转录/翻译信号、以及使得基因更容易操纵的序列。

按照本发明的另一个方面，提供包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸的宿主细胞。所述宿主细胞可以是属于埃希氏菌属(Escherichia genus)的微生物，并且优选为大肠杆菌BL21(DE3)CJ2004-1(保藏号KCCM-10637)。