[发明专利]配对末端测序

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求分别于2005年6月6日提交的美国临时专利申请序 号60/688,042、2005年9月16日提交的60/717,964和2006年2月8 日提交的60/771,818的优先权，这些临时专利申请的内容通过引用结 合到本文中。

在本文中提及的每个申请和专利以及在每个申请和专利中提及 的每个文件或参考文献(包括在每个授予专利的审查过程中提及的； “申请提及的文件”)，对应于和/或要求任何这些申请和专利的优先 权的每个美国和外国申请或专利，以及在每个申请提及的文件中提及 或援引的每个文件，都明确通过引用结合到本文中。更一般地讲，在 本文中(或者在权利要求书之前的参考文献清单中，或者在文本自身当 中)提及的文件或参考文献；和这些文件或参考文献中的每一个(“本 文提及的参考文献”)，以及在每个本文提及的参考文献中提及的每个 文件或参考文献(包括任意生产商的说明书、操作指南等)，都明确通 过引用结合到本文中。通过引用结合到本文中的文件可用于实施本发 明。

政府利益

本发明由美国政府支持，NIH授予的资助号为R01HG003562。 美国政府可在本发明中具有一定权利。

发明领域

本发明涉及核酸测序、基因组测序以及测序结果组装成连续序列 的领域。

发明背景

一种测序大的目标核酸(如人基因组)的方法是使用鸟枪法测序。 在鸟枪法测序中，目标核酸被片段化或亚克隆，以产生一系列重叠的 核酸片段，并测定这些片段的序列。基于各个片段的序列的重叠和信 息，可构建目标核酸的完整序列。

鸟枪法测序的一个缺点是，如果目标核酸序列包含众多小重复片 段(串联重复或反向重复)，则组装可能很难。没有在重复区中组装基 因组序列的能力导致在组装序列中出现空位。因此，在核酸序列的初 始组装后，序列范围中的空位必须要填补，组装中的不确定性必须要 解决。

一种解决这些空位的方法是使用较大的克隆或片段进行测序，因 为这些较大片段应长得足以覆盖重复区。但是，在目前的测序装置中 大核酸片段的测序更难且更耗时。

另一种覆盖序列中空位的方法是测定大片段的两个末端的序列。 与鸟枪法测序片段一个末端的单个读出序列相比，两个末端的一对读 出序列具有已知的间距和方向。使用相对长的片段还有助于组装含散 布重复元件的序列。该类型的方法(Smith，M.W.等，Nature Genetics 7： 40-47(1994))在本领域被称为配对末端测序。本发明包括可用于配对- 末端测序法和其它核酸技术的新方法、系统和组合物。

发明简述

本发明的一个实施方案涉及一种获得DNA构建物的方法，所述 DNA构建物包含目标核酸的两个末端区域，所述目标核酸可为生物基 因组的大节段。所述方法包括以下步骤：

(a)片段化大核酸分子，以产生目标核酸；

(b)将捕捉元件连接至目标核酸，以形成第一环形核酸分子；

(c)用切割目标核酸但不切割捕捉元件的限制性内切核酸酶消化 第一环形核酸，以产生含目标核酸的两个末端的线性核酸，所述两个 末端由捕捉元件分隔；

(d)将线性核酸与分隔元件连接，以形成第二环形核酸；

(e)将第二环形核酸转变为环形单链核酸；

(f)使第一寡核苷酸与环形单链核酸退火，并通过滚环扩增来扩增 环形单链核酸，以产生单链滚环扩增产物；

(g)使第二寡核苷酸与单链滚环扩增产物退火，以在单链滚环扩增 产物中形成多个双链区；和

(h)使用切割多个双链区的限制性内切核酸酶将单链滚环扩增产 物消化为小片段，以产生含目标核酸的两个末端区的DNA构建物。

本发明的另一个实施方案涉及获得含目标核酸两个末端区的 DNA构建物的第二种方法。所述方法包括以下步骤：

(a)片段化大核酸分子，以产生目标核酸；

(b)将连接物连接至目标核酸的每个末端；

(c)将特征标签连接至目标核酸，以形成环形核酸分子；

(d)用切割目标核酸但不切割连接物或特征标签的限制性内切核 酸酶消化环形核酸，以产生含目标核酸的两个末端区的DNA构建物。