[发明专利]大肠癌标记的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于诊断大肠癌及大肠腺瘤的对选自COX-2、SNAIL以及MMP-7的一种以上的肿瘤标记(其中，排除仅为COX-2或MMP-7中的任一种)进行检测的方法，还涉及含有这些肿瘤标记的大肠癌及大肠腺瘤诊断用的试剂盒。

背景技术

由于大肠癌而死亡的患者在逐年增加。在由于癌症而死亡的全部患者中，由于大肠癌死亡的男性排第四位，女性排第二位(1999年度癌症死亡的统计)。此外，预计在2015年的癌症患者中，男女均将上升到第一位，因此希望出现包括二级预防在内的综合的大肠癌对策，癌症群体筛选检查是最有效的方法之一。

为了进行癌症群体筛选检查(mass screening)，简便且非侵袭性的检测方法是重要的。现在能利用的唯一一种非侵袭性方法是检查有无潜血的粪便检查，即便潜血检查，已广泛用作大肠癌群体筛选检查的标准方法。

然而，由于在粪便中出现血红蛋白并不是肿瘤的特异性标记，因此便潜血检查的敏感度及特异性均较低(敏感度30-90％、特异性70-98％)，因此存在出现不少假阴性、假阳性情况的缺点。

此外，在大肠癌的诊断中，在免疫学的便潜血法的筛查后或同时，还要进行全大肠内窥镜检查或灌肠检查以及S状结肠内窥镜检查的组合检查，存在耗费很长时间以及很多精力的缺点。

已经报导了检测粪便中的K-ras、p-53、APC基因突变以及微卫星不稳定性等使用DNA的方法来代替便潜血检查法(非专利文献1-4)。

这些使用DNA的方法是可以非侵袭性地捕捉癌细胞的直接变化的方法，具有特异性高的特征，被认为是将来很有发展前景的方法。但是，与现有技术的便潜血检查相比，其敏感度较低，并且也具有相当耗费时间及精力的缺点。

此外，作为代替便潜血检查的另一种方法，为了比基因检查更直接，还开发出一种检测粪便中的蛋白质激酶C(PKC)等的mRNA的检测方法(非专利文献5-7)。

然而，即使通过上述使用RNA的方法，也不能从少量的粪便中简便且有效地提取出RNA，无法得到优于便潜血法的敏感度。

已知将PCR法与逆转录酶反应(RT)组合用于对RNA进行定性或定量的检测方法。这种RT-PCR法在能够检测微量分子的敏感度的高度方面，较RNA印迹法更优，另外，在操作的速度或易度上较原位(in situ)杂交法更优。

然而，由于RNA没有DNA稳定，并且具有常常被普遍存在于全部生物学样品中的极稳定的RNA分解酶(RNase)分解的危险，因此，就RT-PCR法来说，必须对RNA纯化过程及纯化后进行严格管理，防止混入RNase。

因此，在从粪便这种生物学上极其粗制的样品中提取RNA的时候，为了消除RNase的影响，预先对细胞组分进行分离的步骤是必需的。

因此，从具有来源于多种微生物的极大量的RNase的粪便中直接检测RNA是不可能的。通常认为必须进行细胞组分的分离，以至少除去来自微生物等的外因性RNase。

本发明人开发出一种在有RNA分解酶抑制剂存在的情况下，对根据情况冻结的生物学样品进行均质化，从粪便中检测对于诊断大肠癌有用的肿瘤标记的方法(专利文献1)。

最近，虽然开发出一种检测粪便细胞组分的CD44突变体的表达的方法来代替便潜血法作为大肠癌筛查法，但是这种方法的敏感度只不过大约68％，不及便潜血法的敏感度(大约75％)(非专利文献8)。

专利文献1：WO2004/083856A1

非专利文献1：D.Sidransky等著，Science，第256卷，1992年4月3日，第102页-第105页

非专利文献2：S.M.Dong等著，Journal of the National CancerInstitute，第93卷，第11号，2001年6月11日，第858页-第865页

非专利文献3：G.Traverso等著，The New England Journal ofMedicine，第346卷，第5号，2002年1月31日，第311页-第320页

非专利文献4：G.Traverso等著，The Lancet，第359卷，2002年2月2日，第403页-第404页

非专利文献5：L.A.Davidson等著，Carcino genesis，第19卷，第2号，1998年，第253页-第257页

非专利文献6：R.J.Alexander和R.F.Raicht等著，DigestiveDiseases and Sciences)，第43卷，第12号，1998年，第2652页-第2658页