[发明专利]固定有探针的载体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备固定有探针的载体的方法，该载体含有固定在基板上并能够检测目标物质的探针。

背景技术

作为用于快速而精确地测定核酸的碱基序列、检测样品中具有特异性目标碱基序列的核酸和鉴定不同细菌物种的技术之一，这里提出了具有许多排列在固相支持物上的探针的固定有探针的载体(探针阵列)的应用。这里使用的术语“探针”指的是通过杂交反应特异地和目标核酸结合的物质，当所述物质是核酸时，它可以指的是探针核酸。已经知道多种可用于将探针固定在固相支持物上的方法。具体而言，例如，作为例示性的方法有：通过在固相支持物上连续合成探针来进行探针的固定的方法(即芯片上(on-chip)法)，和通过使用针法、压印等将探针提供到基板上来固定先前准备好的探针的方法。美国专利No.5143854公开了下述方法，所述方法通过活化剂从基板的选定区域去除保护性基团，具有可去除的保护性基团的单体被反复地结合在所述区域来在基板上合成具有不同序列的多聚物。更进一步地，例如，日本专利申请公开号H08-023975公开了下述方法，通过该方法将用于固定探针的材料与生物活性物质接触因而将探针固定在基板上，其中，用于固定探针的材料由基板和携带在基板上的由具有碳二亚胺基团的聚合体化合物构成的用于固定的材料组成，生物活性物质具有与碳二亚胺基团的反应性。进一步，例如，日本专利申请公开号2001-178442公开了下述方法，通过该方法使其末端含有巯基的DNA片段在液相中与固相载体接触，其中，线性分子的一端固定在固相载体的表面，该线性分子具有能够和巯基反应并共价结合巯基的反应基团。这样，由于DNA和线性分子可以共价相互结合，DNA片段被固定在固相载体的表面。更进一步，例如，日本专利申请公开号2000-295990描述了下述方法，所述方法通过溶解或分散DNA片段和亲水聚合物到水性介质中而制备水溶液，将该水溶液点样在固相载体的表面来稳定DNA片段和固相载体表面的结合。

像上面描述制备的探针阵列通常被期望具有高灵敏度。这是因为当待用探针阵列检测的目标物质的浓度低时，由于S/N比例降低，就会出现检测结果的可靠性的问题。因而，对通过提高探针浓度来改善探针阵列敏感度的方法进行了尝试，从而需要提高想要固定在基板上的探针的数量。

然而，对于像上面描述而制备的探针阵列来说，相对于可以和基板上的探针结合的反应基的数量，结合的探针的数量可能变为饱和。结果，在已点样在基板上的包含探针的液滴中，未反应的探针可能以原状存在。进一步，当在这种条件下的所述液滴通过用水、清洁剂等进行液相处理而被去除时，所述未反应的探针可能流到已点样有未反应探针的区域(“点样区域”)以外的区域。结果，所述探针可以被固定在位于所述基板的点样区域以外的区域(“背景区域”)中的反应基上，因此导致非特异吸附。术语“非特异吸附”代表在和检测不相关的位置上的目标核酸的吸附或结合，并且其与吸附和结合的方式无关。另外，当经点样的液滴被去除到液相中，同时未反应的探针存在其中时，流出的探针可能会污染临近的点样区域。结果，仅仅应该固定一种探针的点样区域可能被另一种探针污染。

除了这些因素之外，探针可以结合的基板本身具有导致在其上的探针非特异吸附的因素，因此可能出现问题。换句话说，当目标物质被非特异地吸附在探针阵列的整个背景区域上时，不再能找出点样区域与点样区域周围的背景区域间的分界，结果导致不能判断这是否是检测信号。例如，当在水溶液中显示正电荷的反应基例如氨基存在于基板上，并且被静电吸附在目标核酸的负电荷上时，这个问题便产生了。

按照惯例，为了解决这些问题，尝试了防止目标物质对探针阵列的背景区域非特异吸附的方法。

为了防止目标物质对背景区域非特异吸附，已知的对探针阵列的处理是使用脱脂乳等在探针阵列上进行封闭处理。还已知，通过在探针被固定在基板上之后将探针浸在水性聚合物溶液中来进行封闭处理。例如，像在日本专利号2794728中描述的那样，存在一种通过把探针固定在硝化纤维素膜上，然后把该膜浸在含有PVA和/或PVP的溶液中来进行封闭处理的方法。

然而，无论使用这些封闭试剂中的哪一种，所述封闭试剂通过吸附而不是通过化学键合而结合到固相支持物上。因而，封闭效果不一定是足够的，以至于结果不是总是可重复的。进一步，在制备探针阵列的步骤中，这个方法不能避免未反应探针的非特异吸附。