[发明专利]制备成熟胰岛素多肽的方法

权利要求书

1. 通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备成熟人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。

2. 根据权利要求1的方法，其中所述切割位点是Kex2切割位点。

3. 根据权利要求1或2的方法，其中所述连接肽中对于与A-链接近的切割位点倒数第二位的氨基酸残基选自Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Met、Val、Ala和Phe。

4. 根据权利要求3的方法，其中所述氨基酸残基选自Leu和Ile。

5. 根据权利要求1-4的方法，其中所述连接肽的大小为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。

6. 根据权利要求1的方法，其中所述胰岛素类似物具有在A8、B10、A18和A14位中至少之一的突变。

7. 根据权利要求6的方法，其中所述突变选自Asp、Glu、His、Gln和Arg。

8. 根据权利要求6的方法，其中所述胰岛素类似物B10Glu、A8His、A14Glu人胰岛素。

9. 根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约50mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。

10. 根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约80mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。

11. 根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约100mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。

12. 根据权利要求1-11的方法，其中所述真菌细胞是酵母细胞。

13. 根据权利要求1的方法，其中所述人胰岛素前体类似物具有氨基酸序列

B(1-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)

其中B(1-30)是人胰岛素B-链或其类似物，A(1-21)是人胰岛素A-链或其类似物，各X和各Y各自独立为Lys或Arg或Yps1位点，且Z为1至约35个氨基酸残基的肽序列，附带条件是人胰岛素A-和/或B-链中至少一个天然氨基酸残基突变为另一个氨基酸残基。

14.根据权利要求13的方法，其中Z的大小为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。

15. 根据权利要求13的方法，其中X-X和Y-Y均为Kex2位点。

16. 编码具有以下氨基酸序列的胰岛素前体的DNA序列

B(1-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)

其中，B(1-30)是人胰岛素B-链或其类似物，A(1-21)是人胰岛素A-链或其类似物，各X和各Y各自独立为Lys或Arg或Yps1位点，且Z为1至约35个氨基酸残基的肽序列，附带条件是人胰岛素A-和/或B-链中至少一个天然氨基酸残基突变为另一个氨基酸残基。

17. 含有根据权利要求16的DNA序列的表达载体。

18. 用根据权利要求17的载体转化的酵母细胞。