[发明专利]核酸的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从生物材料中提取核酸的方法。

背景技术

核酸的提取方法主要分为两种，即在溶液状态下进行提取的方法以及固体材料介入的方法，在后一种方法中，通过使含有核酸的溶液与该固体材料接触而使得所述核酸被吸附，并对所述核酸进行洗涤，然后再使所述核酸解吸附。

在溶液状态下进行提取核酸的方法中，最早使用的提取方法是通过将经乙醇沉淀后的核酸粘着在玻璃棒上来进行的。这种方法虽然非常方便，但是在产率和纯度方面存在较大的问题。

作为改善上述问题的方法，例如在提取RNA时，已知有下列方法：P.D.Siebert和A.Chenchik在Nucleic Acids Res.，21，2019-2020(1993)中所描述的AGPC(酸胍-酚-氯仿)法，在该方法中，通过加入异硫氰酸胍使细胞裂解，然后在酸性条件下使用苯酚来除去共存的DNA；以及胍-氯化铯离心方法，该方法利用了RNA的浮游密度高于DNA和蛋白质。然而，这些方法有许多缺点，例如需要使用有毒的有机化合物(例如苯酚和氯仿)，难以回收分子量较小的RNA，需要复杂的操作以及需要熟练的技术来进行精确的提取。

作为改善所述这些缺点的方法，已经开发出这样的方法，其中通过使用能够抑制核酸酶或类似的酶(其能够促进核酸的降解)的硫氰酸胍或类似的离液盐来使细胞裂解、并向其中加入乙醇，从而制备出裂解物溶液；使该裂解物溶液与能够吸附核酸的二氧化硅或类似的固体材料接触；对该材料进行洗涤；然后使核酸解吸附(R.Boom等，Journal of Clinical Microbiology，28，495-503(1990))。

作为另外一种方法，已经开发出利用磁性二氧化硅颗粒的核酸提取方法，并且对该方法的反应效率和洗涤效率进行了改进。此外，已经开发出利用多孔膜的核酸提取方法(JP-A-2003-128691)，这样可以通过简便的方法在短时间内获得高纯度的核酸。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种分离和纯化核酸的方法，在该方法中，分析物中的核酸被固相的表面所吸附，然后通过洗涤等步骤使该核酸解吸附。本发明的另一个目的是提供一种利用固相来分离和纯化核酸的方法，该方法具有优异的分离性能和良好的洗涤效率，并且容易操作，而且采用该方法能够大规模生产出具有基本上相同的分离性能的物质，此外，本发明的另一个目的是提供一种适用于实施所述方法的核酸分离纯化单元。本发明的另外一个目的是通过使用无需特殊技术、复杂操作和特殊装置的小型装置来方便快捷地分离和纯化核酸。本发明的再一个目的是在进行提取操作时通过改善堵塞来实现在保持高收率和高纯度的同时改善裂解物溶液和洗涤液的穿过速率。

本发明的目的在于通过以下方法来分离和纯化核酸，所述方法为使生物材料裂解；并使该生物材料中所含的核酸成分与容器接触，所述容器是通过将诸如多孔膜之类的固体材料固定在容器(例如柱)中制备而成的。本发明涉及可以用于以下条件的方法，所述条件为可以使裂解物溶液和洗涤液的穿过时间缩短，同时，可以使在常规方法中由于发生堵塞而不能穿过的细胞种类和细胞个数在不发生堵塞的条件下穿过。为了开发出这样的方法，使用分散介质(特别是磷酸盐缓冲液或Bis-Tris缓冲液)对以下多种条件进行试验，所述条件例如有：在具有使生物材料发生裂解的作用的裂解液中的表面活性剂和离液盐的浓度；在加入裂解液之后进行的移液操作；在加入水溶性有机溶剂之后进行的搅拌操作；其中密封有固体材料的柱，例如通过将多孔膜密封于具有两个开口的容器中而制得的核酸分离纯化柱；密封于所述柱中的膜的孔径，最后发现通过联合使用所述的这些条件可以达到上文所述的目的，由此完成本发明。即，本发明由以下内容构成。

(1)一种核酸的提取方法，该方法包括：

(a)通过以下步骤(i)或(ii)制备含有溶液的生物材料：

步骤(i)，制备含有磷酸盐缓冲液或Bis-Tris(N，N-双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)缓冲液的生物材料；或

步骤(ii)，用Bis-Tris缓冲液替换生物材料中所含有的缓冲液；

(b)通过使所述的生物材料与裂解液接触来使该生物材料溶解，并溶出该生物材料中所含有的核酸；

(c)通过向由步骤(b)制得的含有溶出的核酸的溶液中加入水溶性有机溶剂来制备裂解物溶液；

(d)通过使所述的裂解物溶液与固体材料接触来使得该裂解物溶液中所含有的核酸被所述的固体材料吸附；

(e)洗掉残留在所述的固体材料中的除了待提取的核酸之外的杂质、和裂解液；以及