[发明专利]通过胰蛋白酶变体切割胰岛素前体

权利要求书

1.制备胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物的方法，其中：

(a)用由序列SEQ ID.NO：3表征的Ser172Ala猪胰蛋白酶切割前- 胰岛素原、前-胰岛素类似物原或前-胰岛素衍生物原，

(b)将得到的切割产物分离并且

(aa)如果得到的切割产物之一是胰岛素类似物或胰岛素衍生物，则 得到该胰岛素类似物或胰岛素衍生物，或

(bb)将是胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物前体的那些切割产 物进一步处理，并且分离并得到从此进一步处理得到的胰岛素、胰岛素类 似物或胰岛素衍生物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述胰岛素是人胰岛素。

3.根据权利要求1的方法，其中所述胰岛素类似物选自包含 Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B28Asp人胰岛素、其中第B28位的脯氨酸已经被 Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代并且第B29位的Lys可以被Pro取代的 人胰岛素；AlaB26人胰岛素；去B28-B30人胰岛素；去B27人胰岛素和去 B30人胰岛素的组。

4.根据权利要求1的方法，其中所述胰岛素类似物是谷赖胰岛素。

5.根据权利要求1的方法，其中所述胰岛素类似物是甘精胰岛素。

6.根据权利要求1的方法，其中所述胰岛素衍生物选自包含B29-N- 肉豆蔻酰-去B30人胰岛素、B29-N-棕榈酰-去B30人胰岛素、B29-N-肉豆 蔻酰人胰岛素、B29-N-棕榈酰人胰岛素、B28-N-肉豆蔻酰Lys^B28Pro^B29人 胰岛素、B28-N-棕榈酰-Lys^B28Pro^B29人胰岛素、B30-N-肉豆蔻酰 -Thr^B29Lys^B30人胰岛素、B30-N-棕榈酰-Thr^B29Lys^B30人胰岛素、B29-N-(N- 棕榈酰-Y-谷氨酰)-去B30人胰岛素、B29-N-(N-石胆酰-Y-谷氨酰)-去B30 人胰岛素、B29-N-(ω-羧基十七酰)-去B30人胰岛素和B29-N-(ω-羧基十七 酰)人胰岛素的组。

7.根据权利要求1至4和6的任一项的方法，其中作为胰岛素、胰岛 素类似物或胰岛素衍生物前体的那些切割产物的进一步处理包括用羧肽酶 B切割所述产物。

8.根据权利要求1至7任一项的方法，其中用Ser172Ala猪胰蛋白酶 切割在7.5至9.5范围的pH值、1℃至30℃的温度下进行；并且通过酸化 样品终止酶促反应。

9.根据权利要求8的方法，其中切割在8.3的pH值、8至12℃之间 的温度下进行，并且通过加入1N或2N HCl溶液进行酸化。

10.由序列SEQ ID.NO：3表征的Ser172Ala猪胰蛋白酶。

11.编码由序列SEQ ID.NO：3表征的Ser172Ala猪胰蛋白酶的DNA。

12.根据权利要求11的DNA，其通过序列SEQ ID.NO：4表征。

13.通过序列SEQ ID.NO：6表征的编码Ser196Ala猪胰蛋白酶原的 DNA。

14.包含根据权利要求11、12或13任一项的DNA的载体。