[发明专利]用于在体内进行蛋白质的选择性进化的方法

说明书

描述

本发明涉及在体外进化方法中产生蛋白质的变体。

发明背景

生物技术在医学、化学工业和农业科学领域中的日益增加的重要性日益需要对于其各自使用目的而经最佳调整的蛋白质。首先，这些蛋白质主要是从环境中分离的，大部分在所谓的环境基因组筛选(Metagenom-Screenings)的范围内。逐渐地，它们随后通过各种方法进行改造以使它们适应计划的“人工”使用条件。

因此，例如，需要与它们的天然变体相比更为热稳定、具有其他底物特异性或者显示更高活性的酶。例如药物蛋白质应当具有更长的半衰期以能够使用更少的剂量，或者应当通过与靶分子的高亲和力和特异性结合来抑制疾病相关性代谢途径或感染途径。

现有技术

部分地通过合理的蛋白质设计方法来达到该调整。然而，迄今从蛋白质的所希望的功能(表型)推断出其结构，或者从蛋白质的三维结构推导出相应的一级序列的可能性只是非常有限的。然而为了实现蛋白质功能的增加，目前使用部分进化方法，其用术语“定向进化”概括。

根据目前的现有技术，迄今的定向进化方法基本上基于产生待改善的蛋白质的大量变体(后代)，并就改善的衍生物对其进行选择。在该情况下，所研究的突变体的数目在一些情况下可以是非常巨大的，但通常低于10¹¹。如果考虑只有100个氨基酸的蛋白质，那么理论上存在20¹⁰⁰＝10¹³⁰个不同的其变体。因此，大小为10¹¹的文库只涵盖了可能的变体的非常小的一部分。在这样的文库中发现理论上最佳的变体的概率几乎为零。

为了就与靶分子的最大亲和力来筛选大量的变体，已开发了许多方案(例如，酵母双杂交、细菌展示、噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示)。

对于筛选其他特性例如酶活性，大部分需要允许研究只是相对少量的变体(＜10⁶)的测定法形式。这些方法的共同点是它们被限制于产生突变体文库以及随后对其进行选择。尽管使用这些方案可能手工地来进行复制(＝最后进行的选择的“胜者”的突变体的下一代)，但是其和前述步骤一样费时费力。因此，相应的方法通常只涉及1至2代。因此，所提及的方案在真正的意义上不是进化方法，而更确切地说是现存的变体库的排他性选择(ausschlieβliche Selection)。因此，不能利用在许多代上的逐步适应的潜能，但这是可能从天文数目的可能性中鉴定出最具有活性的变体所必需的先决条件。

具有其三个先决条件(复制、突变和选择)的进化原理能够在给定的系统内导致从简单至高度适应的结构的定向发展。所谓的“盲眼钟表匠(blinden Uhrmacher)”的该模型使得能够产生复杂性而无需设计输入(planerisches Zutun)和无需必要的结构数据知识。

在1989年，Bauer等人(PNAS(1989)86，7937-7941)能够证明，在其中存在Qβ复制酶和在一端接种任何RNA的毛细管之中，发生了连续的进化过程。聚合前沿(Polymerisationsfront)沿着毛细管出现，在该过程中，出现的RNA聚合物进化达到噬菌体特异性序列/二级结构，因为这些序列由复制酶更快速地复制。尽管该实验不具有直接的实际用途，但其清楚地证明复制、突变和选择这三种因素的潜能。

WO 02/22869描述了用于分子文库的体外进化的方法。在其中使用“双杂交”系统。然而，此处只使用具有增加的错误率的聚合酶，但不使用逆转录酶。因此该文献涉及所谓的“易错PCR”。

WO 2004/024917描述了用于酶的定向进化的方法，其中蛋白质和其编码DNA在空间上偶联并被封闭在区室中。所述蛋白质以具有肽标签的融合构建体的形式存在。起始材料为DNA文库。然而，对于选择不使用配体-蛋白质相互作用，并且RNA聚合酶并不引入突变。

WO 2005/030957公开了以融合蛋白偶联至编码DNA的蛋白质的体外选择。

Bernath，K.等人(J.Mol.Biol.(04.02.2005)345(5)，1015-1026)也描述了相似的系统。

WO 01/51663公开了用于修饰核酸的整合的系统和方法。在其中，特别地使用利用Qβ复制酶的NASBA。然而，没有公开关于通过RNA聚合酶引入突变的提示。

尽管已知由逆转录酶和其他蛋白组成的融合蛋白，但是并没有关于在体外进化中使用RT融合蛋白或T7-RNA聚合酶融合蛋白的提示。