[发明专利]表达靶向内腔的蛋白质的转质体植物

说明书

本发明涉及在植物细胞的类囊体内腔(thylakoid lumen)中表达重组蛋白质的构建物和方法。

植物质体(plastid)(叶绿体、淀粉体、黄化质体、色质体等)源自称为前质体的共同前体，这些植物质体负责重要化合物，例如氨基酸、复杂的碳水化合物、脂肪酸和色素的产生。植物细胞通常含有500-10,000个拷贝的120-160千碱基的小环状质体基因组，其含有单拷贝和复制的DNA区段。因此，可工程改造植物细胞使之含有最多达20,000个拷贝的特定感兴趣基因，从而可能极高水平地表达外来基因并累积重组蛋白质最高达细胞可溶性总蛋白质的40％(De Cosa等，2001，Nat.Biotechnol.19，71-74)。此外，叶绿体转基因品系中未见基因沉默的报道，虽然转录物的累积水平比细胞核转基因植物高169倍(Lee等，2003，MoI.Breeding，11，1-13)。另外，大多数植物的质体是母体遗传的。所以与细胞核中表达的异源基因不同，质体中表达的异源基因不能经花粉传播。因而极大限制了此种转基因在环境中的散播和传播至毗邻植物的风险。

就结构而言，叶绿体是复杂的细胞器，其包含三种不同的可溶相(solublephase)。叶绿体为双层膜的包膜(double-membrane envelope)所包围，该包膜封闭形成膜间隙(intermembrane space)。主要的可溶相是间质，这是(发生)碳固定、氨基酸合成和许多其它途径的部位。主膜(dominant membrane)是捕捉光并合成ATP的广泛交联的类囊体网络。类囊体的膜封闭第三可溶相，形成类囊体内腔，其中容纳了许多外源性光合成蛋白质以及许多其它蛋白质(C.Robinson等，2001，Traffic2：245-251)。

只有少数叶绿体蛋白质在该细胞器内编码与合成。大多数叶绿体蛋白质在细胞核中编码，在细胞质中合成为前体蛋白并在翻译后转运入叶绿体亚区室之一。由于必须通过所存在的不同膜系统，因而需要特定的可能特别复杂的细胞分选信号。

已表征了使蛋白质靶向叶绿体的类囊体内腔的两种不同分泌途径。第一条途径是涉及细菌中SecYEG输出机制的Sec-依赖性途径。第二条途径是pH-依赖性机制，其特征在于转运肽(transit peptide)中有两个连续的保守性精氨酸，即Tat(双生精氨酸转运酶)途径。经Sec途径靶向内腔的蛋白质通常以未折叠的状态转运，而经Tat途径输入的蛋白质可以折叠状态转运。类囊体的加工蛋白酶加工通过任一途径输入内腔的蛋白质，切除所转运肽的羧基端部分(C.Robinson等，traffic 2001，2：245-251)。

叶绿体的类囊体内腔可能是累积某些重组蛋白质的最佳植物细胞区室，因为其氧化稳定性高并含有特定蛋白酶(Z.Adams等，TRENDS in Plant science，第7卷，No 10，2002)。尽管如此，很少考虑将其用于重组蛋白质的靶向和累积。

美国专利US 6,512,162将抑肽酶编码序列与petA基因融合，从而使融合的petA::抑肽酶蛋白能靶向植物细胞的类囊体膜。PetA是编码细胞色素f(petA)蛋白的叶绿体基因组的基因，已有报道说该蛋白是含有位于叶绿体类囊体膜中的跨膜区的多肽，其N-末端区域在类囊体内部空间(intrathylakoid space)中，而15个氨基酸的C末端序列在基质中(SJ.Rothstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第82卷，第7955-7959页，1985)。因此，petA::抑肽酶融合蛋白中的抑肽酶应位于基质中，其中抑肽酶编码序列与细胞色素f(petA)编码序列的3’末端相连。

因此，仍需要能明确将感兴趣肽定位于叶绿体类囊体内腔中的方法和手段。

本发明首次提供利用细胞核所编码蛋白质的内腔靶向信号序列，使由整合入叶绿体基因组中的转基因编码的重组蛋白质靶向叶绿体类囊体内腔的有用核酸序列。

这种方案利用整合入叶绿体基因组中的转基因的高水平表达，从而使大量重组蛋白质累积在具有特定特征，特别是氧化还原特性、含有蛋白酶和折叠活性的细胞区室中。

此外，采用此方案可能在植物叶绿体中产生具有非甲硫氨酸N-末端的重组蛋白质。

附图简述

图1：质粒pAPR20的图谱

本发明的主题是一种嵌合型基因，其包含按照转录方向以功能方式彼此相连的：

a)在植物质体中有功能的启动子，