[发明专利]用于增加细胞培养物的寿命和蛋白收率的改良方法和组合物

说明书

发明领域

[0001]本发明的多个实施方案涉及增加细胞系的寿命和/或蛋白收率的方法和组合物。在具体的实施方案中，所述细胞系可为生产抗体或抗体片段的杂交瘤细胞系。在更具体的实施方案中，所述方法可包括用一种或多种基因(例如编码E6、E7和/或Bcl-2或相关蛋白的基因)转染细胞系。这些蛋白不限于其天然序列，而是可包括一个或多个置换的氨基酸，例如具有T69E、S70E和S87E点突变的Bcl-2。其它实施方案涉及能够在无血清培养基中生长和生产蛋白的哺乳动物细胞系。可通过用表达异源蛋白的表达载体转染这些细胞系而将这些细胞系用于蛋白生产方法，所述异源蛋白例如为抗体、双特异性抗体、多价抗体或多特异性抗体或其片段。在优选实施方案中，所述细胞系可在无血清培养基中被转染，由于避免了必须使转染细胞系适应无血清生长和蛋白生产，因而提供了可观的时间节省。

发明背景

[0002]在体外、尤其是在大生物反应器中培养细胞已成为生产众多生物技术产品的基础，包括由这些细胞将蛋白产物加工到支持介质中，由此支持介质分离这些产物，并进一步加工，然后临床使用。培养物中生长的细胞随时间变化的蛋白生产量取决于众多因素，例如细胞密度、细胞周期、蛋白的细胞生物合成速率、用于支持细胞存活率和生长的培养基条件状况以及培养物中的细胞寿命(即它们需要多长时间死于程序性细胞死亡或凋亡)。已开发了各种改善培养物中的细胞存活率和寿命的方法，以及通过例如控制营养、细胞密度、氧和二氧化碳含量、乳酸脱氢酶、pH、摩尔渗透压浓度、分解代谢产物等增加所需蛋白的生产率的方法。例如，增加细胞密度可使该过程更高产，但也能降低培养物中的细胞寿命。因此，可能期望在达到最大密度时降低培养物中这些细胞的增殖速率，以便将细胞群尽可能长时间地保持在其最高产状态。这导致增加或延长了处于其生产高峰的生物反应器周期，加工目标蛋白产物的时间段更长，并且这导致生物反应器周期收率的更高。

[0003]已寻求许多不同的方法来增加生物反应器周期时间，例如调节支持细胞增殖的培养基、加入某些生长促进因子以及抑制细胞增殖而不影响蛋白合成。一个具体方法的目的就在于通过使用影响细胞周期靶的基因或反义寡核苷酸控制细胞周期来增加培养细胞的寿命，从而通过用阻止细胞周期发展和诱导所谓的假衰老状态的载体来转染、转化或感染而将细胞诱导至假衰老阶段，所述假衰老状态阻断进一步的细胞分裂，并扩大培养物中所述细胞的蛋白合成能力；换句话说，假衰老状态可通过用表达细胞周期抑制剂的载体转染细胞来诱导(Bucciarelli等，美国专利申请2002/0160450 A1；WO 02/16590 A2)。后一种方法通过抑制细胞复制设法迫使细胞进入可具有延长的细胞培养物寿命(如Goldstein和Singal，Exp Cell Res 88，359-64，1974；Brenner等，Oncogene 17：199-205，1998所述)并可抗凋亡(Chang等，Proc Natl Acad Sci USA 97，4291-6，2000；Javeland等，Oncogene 19，61-8，2000)的状态。

[0004]另一个方法涉及建立在用腺病毒E1基因转染后无限增殖的原代二倍体人细胞或其衍生物。新细胞系(其中一种是表达功能性Ad5 E1A和E1B基因产物的PER.C6(ECACC保藏号96022940))可生产重组腺病毒以及设计用于基因治疗和疫苗以及用于生产重组治疗性蛋白(例如人生长因子和人抗体(Vogels等，WO 02/40665 A2))的其它病毒(例如流感病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒、麻疹病毒)。