[发明专利]海萤荧光素发光基质及其制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种与海萤荧光素酶反应的荧光素(发光基质)的制造方法、新型的海萤荧光素化合物和其制造技术的确立。

另外，本发明涉及一种与天然的海萤荧光素发光波长不同的衍生物、背景低的衍生物、组合物、发光测定方法。

背景技术

发光性甲壳类海萤及其近缘物种具有分泌性的发光酶(荧光素酶)和发光基质(荧光素)，海萤荧光素利用以海萤荧光素酶为催化剂的氧化反应而发出最大发光波长为460nm的蓝色的光。

由于荧光素酶具有可分泌到细胞外的特征，因此，当将克隆好的cDNA用作报告基因时，在哺乳类、酵母细胞中合成的蛋白也可分泌到细胞外。因而，由于不破坏细胞就可以测定海萤荧光素酶的发光活性，因此，例如可以在细胞外测定哺乳类细胞内的基因转录活性(非专利文献1～2、专利文献1～3)。另外，可用作酵母细胞中的报告基因检测用分泌型荧光素酶(专利文献4)。

在利用该发光酶的报道中有如下例子：通过将该分泌型发光酶进行图像分析而使来自细胞的蛋白质的分泌直观化的例子(非专利文献3)；通过使用将插入了生长激素基因的转录活性区域的海萤报告基因导入的哺乳类细胞，连续地测定生物细胞中的转录活性的变化的例子(非专利文献4)。另外，也有利用海萤荧光素酶和荧光蛋白的融合体将来自蛋白质的活性肽的处理进行定量的例子(专利文献5)。

在制药领域中，蛋白表达抑制剂及分泌抑制剂等的开发及探索是重要的，以细胞内的目标蛋白质的基因转录活性的变化为指标进行筛选。传递伴随抑制剂的效果的基因转录活性的变化是报告基因(蛋白质)的任务。作为报告蛋白质，要求不仅通知基因的ON/OFF、而且可以分析抑制剂效果的时效变化(时间分解能高)，或者，要求具有对报告蛋白质本身不具有抑制效果或不干扰细胞内功能(无细胞毒性)等特性。作为实现高的时间分解能且没有细胞毒性的报告基因，需要快速地分泌或代谢在细胞内制作成的报告蛋白质。

海萤荧光素酶被分泌且可以快速地测定细胞外转录活性的变化，因此，其用途广泛。虽然是唯此有用的报告酶，但海萤荧光素酶的实用化·通用化还在观望中。这是因为作为基质的荧光素存在不能充分供给的较大问题的缘故。

另外，作为海萤荧光素的问题，可列举：荧光素难以稳定供给、荧光素和白蛋白蛋白质等的自发光、发光波长与其他发光体系重叠等。

迄今为止，报道过的海萤荧光素的合成都以作为前体的初荧光素(etioluciferin)为中间体。对于初荧光素的合成而言，最短的也需要7个步骤(非专利文献5～7)。由于作为最终步骤的从初荧光素至海萤荧光素的步骤的收率差，需要大量地制备原料，因此，使荧光素的制造成本显著提高。根据现有文献中所记载的方法，用3-甲基-2-氧代戊酸和初荧光素的缩合反应的光学活性的荧光素的合成收率在3阶段为2％(非专利文献5，图1)。如上所述，由于最终步骤的收率非常低，因此，目前的现状是，利用有机合成的光学活性的海萤荧光素难以工业化。

由于外消旋体荧光素(非专利文献7)仅显示出天然荧光素的大约一半的活性、存在不依赖于非天然型荧光素的荧光素酶的发光背景，因此，光学活性的荧光素的合成在生物鉴定中是非常重要的课题。

另一方面，海萤荧光素和海肾荧光素的基本骨架为咪唑并吡嗪酮骨架，因此，最大发光波长接近，根据荧光素酶结构而稍有不同，都为约460nm-约480nm，难以同时测定这两个发光体系。

另外，虽然存在利用海萤荧光素酶和荧光蛋白的融合体将来自蛋白质的活性肽的处理定量化的例子，但由于海萤荧光素酶的发光最大值(460nm)与荧光蛋白的发光最大值(525nm)之差(stokes shift)较小、为60nm，因此，可看到海萤荧光素酶的发光对荧光蛋白的荧光的干涉。该光干涉在利用荧光蛋白的肽的处理定量化中成为高背景。期望开发最大发光波长不同的海萤荧光素类似物。

而且，海萤荧光素利用培养液中的白蛋白等而发生化学发光，为量子收率低的发光。由于自发光为不依赖于荧光素酶量的发光，因此可在细胞内的海萤荧光素酶的成像或转录活性的测定等中作为背景来观察。期望开发背景少的海萤荧光素类似物。

目前合成了海萤荧光素衍生物，并发明了用于过氧化物阴离子定量等的化学发光试剂。但是，还没有开发出成为海萤荧光素酶的基质的衍生物。

专利文献1：WO90/01542

专利文献2：特开平3-30678

专利文献3：特开2004-187652

专利文献4：特愿2005-169768

专利文献5：PCT/JP03/15828

专利文献6：特开平-60697号公报