[发明专利]酶的制造方法

说明书

技术领域

本发明是有关酶的制造方法，具体地来说是关于从含有酶的液体中高效率地回收酶的方法。

背景技术

过滤发酵液，除去发酵液中的微粒、培养细胞以及孢子等的不溶解物质并回收作为目的的酶等的发酵产物的方法是众所周知的。但是，在过滤操作中由于接近于分离膜细孔大小的粒子会造成分离膜网眼的堵塞，并且不溶物质将在膜面上堆积，从而会招致过滤效率下降的问题。以前，对于这样的分离膜的物理性的网眼堵塞和膜面上的不溶解物质的堆积，通过一边在膜面上进行扫流(sweep-flow)一边进行过滤等的操作，来避免网眼的堵塞和不溶解物质的堆积，可是在含有高浓度菌体的发酵液的情况下，因为发酵液的粘度较高，所以扫流时的压力损失较大，从而使过滤压力增大，以至于招致在膜面上的不溶解物质的固结化，反而带来了过滤效率下降的问题。

为了解决这样的问题，在JP-A11-318482中，在精密过滤时将阳离子性表面活性剂添加到含有高浓度菌体的发酵培养液中，通过降低发酵液的粘度来抑制扫流时的压力损失和过滤压力的增大，由浓缩率的提高来提高发酵产物的回收率。另外，在JP-A4-354585中，建议在处理发酵液时将絮凝剂(阳离子型高分子物质)添加到发酵培养液中。但是，这些高分子絮凝剂的分子量达数十万，在反复使用时反而会引起膜的网眼被阳离子型高分子堵塞，因此存在膜的清洗恢复变得不可能的问题。

发明内容

本发明是一种酶的制造方法，其特征在于，该制造方法是从菌体的浓度为1％(v/v)以下且酶的浓度为1％(w/v)以上的含酶的液体，通过精密过滤来回收酶的方法，在上述含酶的液体中添加0.01～1％(w/v)的阳离子性表面活性剂并进行精密过滤。并且还提供一种酶的制造方法，其特征在于，从菌体浓度大于1％(v/v)的发酵培养液分离菌体，将所得到的含酶的液体通过超滤来进行精制·浓缩，在所得到的菌体浓度为1％(v/v)以下且在酶的浓度为1％(w/v)的含酶的液体中添加0.01～1％(w/v)的阳离子性表面活性剂并进行精密过滤。

具体实施方式

在蛋白酶等的酶的发酵生产中采用的方法多数是，首先通过精密过滤等从发酵培养液中分离菌体，接着通过超滤来精制·浓缩由分离菌体而得到的含酶的液体。

根据该方法，虽然可以得到菌体浓度为1％(v/v)以下且酶浓度为1％(w/v)以上的含高浓度酶的液体，但是，从完全阻止酶产生菌、去除精制过程中所产生的杂菌、完全去除由于对酶溶液进行高浓度化而产生的不溶物以及残存的少量的杂质等的观点出发，就需要进一步精制·分离该含高浓度酶的液体。

在该含高浓度酶的液体的精制·分离过程中，可以考虑使用精密过滤膜，但像这样的含高浓度酶的液体的情况下，虽然是菌体浓度低且发酵液的粘度不成问题的溶液，还是因为蛋白质浓度高从而在精密过滤时的酶透过率以及透过流量不如人意，并存在生产效率非常差的问题。

另外，一般在通过精密过滤来进行的高蛋白质溶液的精制过程中，会有以下的问题点：即使存在少量的应去除的混入的细菌等的杂质，由于夹杂的ppb级的DNA等，在膜透过过程中的透过流量将会减少，并且蛋白质溶液的透过率变差。作为解决此问题的手段，在JP-A2004-89155中提出了如下方法：在使用膜对蛋白质溶液进行过滤时，用DNA分解酶以及DNase处理蛋白质溶液之后进行过滤，或者，一边进行DNase处理一边进行过滤。但是，在高浓度的蛋白酶的发酵液中，因为DNase本身也是蛋白质，所以不能期待由蛋白酶使得分解容易地进行的效果。

如以上所述，在含高浓度酶的液体的最终的精制·分离即通过精密过滤进行的精制过程中，要体现充分的酶透过率和透过流量是非常困难的，并且还有生产效率非常差的问题。

本发明者研究探讨了在使用精密过滤膜的含高浓度酶的液体的最终的精制·分离中实现充分大的酶透过率和透过流量的方法，其结果完成了上述的本发明。

在本发明中，以菌体浓度为1％(v/v)以下且酶浓度以蛋白质的含量计为1％(w/v)以上的含酶的液体作为对象，通过对其进行精密过滤来回收酶。从在精密过滤过程中降低负荷的观点出发，菌体浓度更优选为0.5％(v/v)以下，特别优选为0～0.3％(v/v)。从根据处理液量和过滤速度的过滤效率以及酶的溶解性的观点出发，酶浓度更优选为2％(w/v)以上，特别优选为2～10％(w/v)。菌体浓度是以在离心效果12000G以及沉淀时间5min的条件下进行离心分离时的相对于含酶的液体量的菌体所占的容积的比例来定义。