[发明专利]维生素D化合物的释放试剂

说明书

背景信息

本发明涉及用于释放与维生素D-结合蛋白相结合的维生素D化合物的试剂组合物，用于检测25-羟基维生素D化合物的方法，其中通过使用这种试剂，25-羟基维生素D化合物从维生素D-结合蛋白中释放，并且分析如此所获得的混合物。本发明还涉及用于释放维生素D化合物的试剂的用途以及检测25-羟基维生素D的试剂盒，其包含用于释放除常见免疫试剂之外的维生素D化合物的试剂。

维生素D的充分供给是必需的，如术语“维生素(vitamin)”早已暗示的那样。维生素D的缺乏导致严重的疾病如佝偻病或者骨质疏松。虽然在上个世纪的早期，维生素D仍然被看作一种单一物质，但是在过去的三十年内，维生素D系统已经变为一种维生素D代谢产物的复杂且多样的网络。如今，40种以上的不同的维生素D代谢产物是已知的(Zerwekh，J.E.，Ann.Clin.Biochem.41(2004)272-281)。

人类只能通过来自阳光的紫外线作用于皮肤上而产生D₃维生素或者维生素D₂(calciferols)。在皮肤中产生的维生素D₃结合到所谓的维生素D-结合蛋白，其将它输送到肝脏中，在此通过25-羟基化作用将它转化为25-羟基维生素D₃。除皮肤和肝脏之外，许多其它组织目前已知涉及维生素D新陈代谢，而上述两个器官早已在下述文献中提及，(参考Schmidt-Gayk，H.et al.(eds.)，″Calcium regulating hormones，vitamin Dmetabolites and cyclic AMP″，Springer Verlag，Heidelberg(1990)pp.24-47)。25-羟基维生素D，更具体地说，25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃，就其数量而言，是人有机体中的重要存储形式。当需要时，这些前体可以在肾中转化而形成生物活性的1α，25-二羟基维生素D，所谓的D激素。生物活性的维生素D尤其调节从肠的钙吸收、骨矿化，并且影响许多其它代谢途径如胰岛素体系。

测量维生素D水平本身是没有多少益处的，当测定患者的维生素D状况时，因为取决于食物吸收，维生素D(维生素D₂和维生素D₃)的浓度变化很大。另外，在循环(24小时)中维生素D具有较短的生物半衰期，因此出于这种原因也不是合适的测定患者的维生素D状况的参数。同样也适用于生理活性形式的维生素D(1，25-二羟基维生素D)。这些生物活性形式同样以较小的且较大变化的浓度存在，相比于25-羟基维生素D而言。由于全部这些原因，特别地，25-羟基维生素D的量化是一种合适的全面分析患者的总的维生素D状况的手段。

25羟基维生素D或者其它维生素D化合物对维生素D-结合蛋白的结合使得维生素D化合物的测定极大地复杂化。全部已知的方法要求待分析的维生素D化合物从其与结合蛋白形成的复合物中释放或者分离。在下文中，为了简化的目的，这被称为从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物，虽然当然其只能从维生素D化合物和维生素D-结合蛋白的复合物中，而不是单独地从维生素D-结合蛋白中被释放。

因为维生素D-结合蛋白具有恰当再摺起的高倾向，通常需要首先释放维生素D化合物，然后使待被分析的维生素D化合物与维生素D-结合蛋白分离。

由于25-羟基维生素D的高的临床价值，许多方法从文献中是已知的，这使得25-羟基维生素D可以或多或少被可靠地测定。

Haddad，J.G.et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.33(1971)992-995，andEisman，J.A.et al.，Anal.Biochem.80(1977)298-305例如描述了使用高压液相色谱(HPLC)测定血液样品中25-羟基维生素D的浓度。

其它测定25-羟基维生素D的方法尤其是基于使用维生素D结合蛋白，如牛奶中存在的那些。因此，Holick，M.F.和Ray，R.(US 5,98 1,779)以及DeLuca等(EP 0 583 945)描述了用于羟基维生素D和二羟基维生素D的维生素D分析，其基于这些物质结合到维生素D-结合蛋白，其中这些物质的浓度是通过竞争性测试程序测定的。然而，这种方法的先决条件是待测定的维生素D代谢产物首先必需从原始的血液或者血清样品中分离并且必需通过例如色谱进行纯化。